發(fā)布時(shí)間：2017-04-25 06:06

  本文關(guān)鍵詞：金鐵鎖HMGR、FPS、SE和P450基因克隆、生物信息學(xué)及表達(dá)分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：稀有瀕危物種金鐵鎖(Psammosilene tunicoides)為石竹科(Caryophyllaceae)單種屬植物,以根入藥,是“云南白藥”的主成分之一,主要有效成分為金鐵鎖三萜總皂苷。金鐵鎖自然繁殖力低,生長(zhǎng)緩慢,加之金鐵鎖藥材大部分依賴野生采挖,使之野生資源日益減少,幾近枯竭,已不能滿足市場(chǎng)需求。從分子水平闡明金鐵鎖三萜總皂苷生物合成途徑,找到控制三萜皂苷合成的關(guān)鍵酶基因,利用基因工程技術(shù)對(duì)金鐵鎖三萜皂苷進(jìn)行體外合成,是獲得金鐵鎖三萜皂苷快速而有效的新途徑。本研究從金鐵鎖中克隆了4個(gè)可能參與三萜皂苷合成關(guān)鍵酶基因,成功構(gòu)建原核表達(dá)體系誘導(dǎo)蛋白表達(dá),檢測(cè)了關(guān)鍵酶基因的組織表達(dá)差異。主要研究?jī)?nèi)容如下:基于課題組前期研究中所獲得的金鐵鎖轉(zhuǎn)錄組信息,從大量轉(zhuǎn)錄本信息中篩選了可能參與金鐵鎖三萜皂苷合成的序列,包括參與三萜前體形成的3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMGR)、法尼基焦磷酸合成酶(FPS),骨架構(gòu)建階段的鯊烯環(huán)氧酶(SE),以及修飾階段的細(xì)胞色素P450單加氧酶(P450)等關(guān)鍵酶基因。根據(jù)轉(zhuǎn)錄本序列,設(shè)計(jì)各基因的全長(zhǎng)擴(kuò)增引物,利用RT-PCR方法獲得金鐵鎖各基因的全長(zhǎng)cDNA序列:獲得全長(zhǎng)1716bp的HMGR,ORF1641bp,編碼546個(gè)氨基酸,蛋白分子量約為58KD;獲得全長(zhǎng)1135bp的FPS,ORF 1029bp,編碼342個(gè)氨基酸,生物信息學(xué)分析FPS蛋白的分子量約為39KD;獲得兩條SE,SE-1全長(zhǎng)1642bp,ORF 1578bp,編碼525個(gè)氨基酸,蛋白分子量約為57.3KD;SE-2全長(zhǎng)1552bp,ORF 1446bp,編碼481個(gè)氨基酸,蛋白分子量約為52.3KD;獲得全長(zhǎng)1612 bp的金鐵鎖P450,ORF 1560 bp,編碼519個(gè)氨基酸,蛋白分子量約為60KD;并構(gòu)建各基因相應(yīng)原核表達(dá)體系成功誘導(dǎo)蛋白表達(dá);對(duì)所編碼的蛋白進(jìn)行了生物信息學(xué)分析,各基因均與其他已知植物的相關(guān)基因有較高同源性;利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組所獲得的金鐵鎖關(guān)鍵酶基因在不同產(chǎn)地不同組織的表達(dá)情況表明:除金鐵鎖P450的趨勢(shì)為在葉中的相對(duì)表達(dá)量最高外,其他酶基因總體趨勢(shì)均是在根中高表達(dá)。首次從金鐵鎖中克隆出HMGR、FPS、SE、P450酶基因并進(jìn)行原核表達(dá)研究,對(duì)三萜合成途徑中的關(guān)鍵酶基因的組織表達(dá)特異性進(jìn)行了初步的檢測(cè),根據(jù)研究結(jié)果推測(cè)所克隆得到的金鐵鎖FPS、SE-1、SE-2、HMGR可能參與三萜皂苷的合成,而得到的P450則可能是參與甾醇的合成。本研究為進(jìn)一步闡明三萜皂苷合成途徑提供重要線索,并對(duì)后續(xù)金鐵鎖合成生物學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：金鐵鎖 基因克隆 原核表達(dá) 實(shí)時(shí)熒光定量 生物信息學(xué)分析
【學(xué)位授予單位】：云南中醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S567.239;Q943.2
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-10
• 縮略詞表10-11
• 前言11-13
• 第一章 金鐵鎖HMGR的克隆、原核表達(dá)及生物信息學(xué)分析13-37
• 第一節(jié) 實(shí)驗(yàn)材料、試劑及儀器13-16
• 1 實(shí)驗(yàn)材料13-14
• 2 實(shí)驗(yàn)試劑14-15
• 3 實(shí)驗(yàn)儀器15-16
• 第二節(jié) 實(shí)驗(yàn)方法16-28
• 1 金鐵鎖HMGR基因克隆16-22
• 2 HMGR基因的原核表達(dá)22-27
• 3 HMGR生物信息學(xué)分析27-28
• 第三節(jié) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果28-37
• 1 金鐵鎖根部RNA的提取28-29
• 2 金鐵鎖HMGR的克隆29-30
• 3 金鐵鎖HMGR的原核表達(dá)30-31
• 4 金鐵鎖HMGR的生物信息學(xué)分析31-37
• 第二章 金鐵鎖FPS的克隆、原核表達(dá)及生物信息學(xué)分析37-47
• 第一節(jié) 實(shí)驗(yàn)材料、試劑及儀器37
• 第二節(jié) 實(shí)驗(yàn)方法37-38
• 第三節(jié) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果38-47
• 1 金鐵鎖FPS的克隆38-39
• 2 金鐵鎖FPS的原核表達(dá)39-40
• 3 金鐵鎖FPS的生物信息學(xué)分析40-47
• 第三章 金鐵鎖SE的克隆、原核表達(dá)及生物信息學(xué)分析47-60
• 第一節(jié) 實(shí)驗(yàn)材料、試劑及儀器47-48
• 第二節(jié) 實(shí)驗(yàn)方法48
• 第三節(jié) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果48-60
• 1 金鐵鎖SE的克隆48-49
• 2 金鐵鎖SE的原核表達(dá)49-50
• 3 金鐵鎖SE的生物信息學(xué)分析50-60
• 第四章 金鐵鎖P450的克隆、原核表達(dá)及生物信息學(xué)分析60-68
• 第一節(jié) 實(shí)驗(yàn)材料、試劑及儀器60
• 第二節(jié) 實(shí)驗(yàn)方法60-61
• 第三節(jié) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果61-68
• 1 金鐵鎖P450的克隆61-62
• 2 金鐵鎖P450的原核表達(dá)62-63
• 3 金鐵鎖P450的生物信息學(xué)分析63-68
• 第五章 金鐵鎖8個(gè)關(guān)鍵酶基因的表達(dá)分析68-77
• 第一節(jié) 實(shí)驗(yàn)材料、試劑及儀器68-69
• 1 實(shí)驗(yàn)材料68
• 2 實(shí)驗(yàn)試劑68-69
• 3 實(shí)驗(yàn)儀器69
• 第二節(jié) 實(shí)驗(yàn)方法69-72
• 1 金鐵鎖根、莖、葉RNA提取69
• 2 cDNA合成69-70
• 3 確定進(jìn)行熒光檢測(cè)的基因及引物設(shè)計(jì)70-71
• 4 Real-time PCR反應(yīng)71-72
• 第三節(jié) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果72-77
• 第六章 討論77-85
• 第七章 文獻(xiàn)綜述85-96
• 第一節(jié) 植物萜類化合物生物合成途徑及其關(guān)鍵酶85-91
• 1 植物萜類化合物生物合成途徑85-87
• 2 甲羥戊酸途徑中的關(guān)鍵酶87-91
• 第二節(jié) 金鐵鎖及其三萜皂苷的研究現(xiàn)狀91-94
• 1 金鐵鎖簡(jiǎn)介91-93
• 2 金鐵鎖三萜皂苷的研究93-94
• 第三節(jié) 實(shí)時(shí)熒光定量PCR94-95
• 第四節(jié) 本研究的目的及意義95-96
• 參考文獻(xiàn)96-102
• 附錄102-109
• 致謝109-110

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  本文關(guān)鍵詞：金鐵鎖HMGR、FPS、SE和P450基因克隆、生物信息學(xué)及表達(dá)分析，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：325757