手性醇是工業(yè)合成藥物、農(nóng)用化學(xué)品、天然產(chǎn)品及某些特殊材料過程中一種重要的手性砌塊。利用羰基還原酶不對稱還原前手性羰基化合物,是合成手性醇的重要方法之一。本文通過構(gòu)建基因挖掘策略,挖掘蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中潛在羰基還原酶,并進(jìn)行了克隆表達(dá)研究。本研究在確定羰基還原酶各家族的氨基酸保守序列后,選取來源于極端嗜熱菌Aeropyrum pernix K1中的羰基還原酶（ApCR）,作為探針酶。以探針酶的氨基酸序列為模板,在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源序列比對、篩選后,構(gòu)建候選酶庫。通過對候選酶序列和探針序列進(jìn)行氨基酸序列比對、二級結(jié)構(gòu)模擬比對、三級結(jié)構(gòu)模擬比對后,確定來源于蠟樣芽胞桿菌Bacilluscereus中的蛋白BcCR,與探針ApCR序列具有相似的二級、三級結(jié)構(gòu),并且都具有羰基還原酶SDRs家族的氨基酸保守序列,推測該蛋白具有與ApCR相似的酶學(xué)性質(zhì)及功能。以B.cereus的基因組DNA為模板,PCR克隆出BcCR基因（738bp）,構(gòu)建重組質(zhì)粒pET 28a-BcCR,并將其導(dǎo)入在E.coli B121（DE3）plysS中,實(shí)現(xiàn)了可溶性表達(dá),蛋白大小約為32kDa。對表達(dá)出的目標(biāo)酶進(jìn)行酶學(xué)性... 

【文章來源】：武漢科技大學(xué)湖北省

【文章頁數(shù)】：73 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖１．１輔酶ＮＴＡＤ（Ｐ）Ｈ氫轉(zhuǎn)移示意圖??Ｆｉｇ．?１．１?Ｄｉａｇｒａｍ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｈｙｄｒｏｇｅｎ?ｔｒａｎｓｆｅｒ?ｆｏｒｍ?ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ?ｔｏ?ｔｈｅ?ｃａｒｂｏｎ??

２．２．２基因挖掘原理??基因挖掘的原理，主要是針對某種特定的生物或整個公共數(shù)據(jù)庫，對已知的??基因或蛋白質(zhì)序列進(jìn)行檢索、分析、篩選，最終獲得目標(biāo)蛋白，流程如圖２．１所??１３??

＿３８４９），與探針酶ＡｐＣＲ的氨基酸序列一致性為３８．４％。氨基酸??序列比對結(jié)果見圖２．４，分析可見二者均包含了?ＳＤＲ家族的活性中心保守區(qū)??Ｙ－Ｘ３－Ｋ，輔因子結(jié)合位點(diǎn)保守區(qū)ＴＧ－Ｘ３－Ｇ－Ｘ－Ｇ。ＢｃＣＲ與ＡｐＣＲ的二級結(jié)構(gòu)模??擬見圖２．５，由圖可見，二者的二級結(jié)構(gòu)，在的ａ螺旋、（３折疊、無規(guī)則卷曲所??在的氨基酸位置及分布區(qū)間相似。ＢｃＣＲ與ＡｐＣＲ的三級結(jié)構(gòu)模擬見圖２．６，可??見二者的三級結(jié)構(gòu)也很相似。??首先，根據(jù)ＢｃＣＲ具有羰基還原酶的催化位點(diǎn)和輔酶結(jié)合位點(diǎn)的氨基酸保守??序列，初步推測其具有羰基還原酶活性。然后，根據(jù)ＢｃＣＲ與ＡｐＣＲ具有相似的??二級和三級結(jié)構(gòu)，初步推測二者具有相似酶學(xué)性質(zhì)。即ＢｃＣＲ為ＳＤＲｓ家族的羰??基還原酶，能催化ＣＯＢＥ還原為相應(yīng)的手性醇，并需要ＮＡＤＰＨ的參與，同時，??該酶可能具有耐高溫和熱穩(wěn)定性較好的特性。??ＡｐＣＲ．ｓｅｑ?．?ＭＥＴ?Ｔ?Ｌ?Ｒ?Ｅｇｌｖ?ｆｇｇ?Ｉ?Ｋ?Ｓ?ＲＡＤ?３９??３ｃＣＲ．ｓｅｑ?邏?４０??Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ?ａｌｌｔｇ?ｓｒｇＴｇｆａ?ａ?９?ｖｖ?ｙ??Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ?ａ?ｅ?Ｘｇｓ?ａ?ｖｒ?ｄｖ?ｄ?ｖｚ?ｍ??ＡｐＣＲ．ｓｅｑ?ＩＦＨｌＮ＼ｇｇｊｇｇｊｌ－ＱＬＧＧＩＥＥＴＳＩ＾￡ＥＴＩ？＼＾Ｉ？＾?１１９??ＢｃＣＲ．ｓｅｑ?臓則＿５：１壓?ＣＴ’、’：Ｎ?邏：２１９??Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ?Ｉｖｎ?ａｇｖ?ｅｗ?ｎｌ?ｇｖ?ｌ??ＡｐＣＲ．ｓｅｑ?＇篇：ＸＬＰＩＸＲＫＡＫＷＡＨ僅?Ｉｓ｜￡ｌｇ＇”＇．：ＡＧＶＡ｜?韋

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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本文編號：3246557