豬（Sus scrofa）內(nèi)皮細(xì)胞的去唾液酸糖蛋白受體1（asialoglycoprotein receptor 1,ASGR1）是誘發(fā)異種肝移植后受體發(fā)生血小板減少癥的主要誘因之一。本研究在α-1,3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因（α-1,3-galactosyltransferase,GGTA1）敲除的五指山小型豬基礎(chǔ)上,利用規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9,CRISPR/Cas9）結(jié)合體細(xì)胞核移植技術(shù)制備ASGR1基因敲除豬,針對豬ASGR1基因設(shè)計并構(gòu)建了靶向表達(dá)載體單鏈導(dǎo)向RNA1（single guide RNA1,sg RNA1）,將sg RNA1與增強綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）質(zhì)粒共同電轉(zhuǎn)染GGTA1基因敲除豬耳成纖維細(xì)胞,流式細(xì)胞儀富集篩選帶綠色熒光的細(xì)胞后培養(yǎng)單細(xì)胞克隆。實驗結(jié)果表明,PCR測序檢測培養(yǎng)獲得的41個單細(xì)胞克隆,37個克隆發(fā)生基因突變,ASGR1基因突變效率為90%,其中雙等位基因... 

【文章來源】：農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報. 2016,24(08)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：8 頁

【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 實驗材料及主要試劑
    1.2 實驗方法
        1.2.1 規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)(clustered regular-ly interspaced short palindromic repeats/Cas9,CRIS-PR/Cas9)打靶載體的設(shè)計及構(gòu)建
        1.2.2 sg RNA基因突變效率檢測
        1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染、篩選及單細(xì)胞克隆鑒定
        1.2.4 基因敲除豬的制備及鑒定
        1.2.5 脫靶效應(yīng)分析
        1.2.6 Western blot檢測
2 結(jié)果與分析
    2.1 sg RNA打靶載體的構(gòu)建及基因突變效率檢測
    2.2 陽性單細(xì)胞克隆鑒定
    2.3 敲除豬的制備及鑒定
    2.4 脫靶分析
    2.5 Western blot檢測
3 討論
4 結(jié)論


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]Generation of GGTA1 biallelic knockout pigs via zinc-finger nucleases and somatic cell nuclear transfer[J]. BAO Lei,CHEN HaiDe,JONG UiMyong,RIM CholHo,LI WenLing,LIN XiJuan,ZHANG Dan,LUO Qiong,CUI Chun,HUANG HeFeng,ZHANG Yan,XIAO Lei,FU ZhiXin.  Science China（Life Sciences）. 2014(02)
[2]利用啟動子缺陷型打靶載體敲除五指山小型豬GGTA1基因[J]. 鄭道山,馮沖,朱彥賓,龍川,馮書堂,潘登科,馬文麗.  生物技術(shù)通訊. 2011(04)
[3]體細(xì)胞核移植生產(chǎn)轉(zhuǎn)ω-3脂肪酸去飽和酶基因sFat-1克隆豬[J]. 潘登科,張莉,周艷榮,馮沖,龍川,劉曉,董恩球,王樹臣,萬榮,張健,陳紅星.  中國科學(xué)（C輯:生命科學(xué)）. 2009(03)



本文編號：3246813