蛋白酶抑制子（proteinase inhibitors,PIs）廣泛存在于動(dòng)植物及微生物中。半胱氨酸蛋白酶抑制子（Cystatin,CYS）主要參與植物種子的萌發(fā)、植物生長發(fā)育、細(xì)胞程序化死亡以及植物對(duì)生物、非生物脅迫的應(yīng)答。馬鈴薯（Solanum tuberosum L.）CYS是存在于其塊莖和植株中的小分子量可溶性蛋白,目前它的研究多集中于對(duì)馬鈴薯脅迫的響應(yīng)和調(diào)控方面。實(shí)驗(yàn)室前期通過RNA-Seq分析發(fā)現(xiàn),CYS可能參與調(diào)控鮮切馬鈴薯的酶促褐變,但尚未得到轉(zhuǎn)基因功能驗(yàn)證;CYS在大腸桿菌（Escherichia coli,E.coli）中表達(dá)能夠提高菌的抗鹽能力。本實(shí)驗(yàn)利用超表達(dá)CYS基因StCYS1的二倍體馬鈴薯“MDS”,驗(yàn)證其抑制褐變和抗鹽的效果,并探究其抑制塊莖褐變和提高植株耐鹽性的機(jī)理。研究還以四倍體馬鈴薯“Desiree”為材料,應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)成功構(gòu)建了StCYS1的基因編輯載體,擬通過獲得馬鈴薯StCYS1突變體植株,探究是否具有增強(qiáng)褐變的表征,旨在為后續(xù)進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:（1）超表達(dá)StCYS1對(duì)二倍體馬鈴薯塊莖酶促褐變的影響。... 

【文章來源】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)山東省

【文章頁數(shù)】：68 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

超表達(dá)StCYS1和野生型二倍體馬鈴薯株系塊莖表型Fig.1ThetuberphenotypesofStCYS1overexpressedandwild-typediploidpotatolines

山東農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文253.1.2超表達(dá)StCYS1對(duì)馬鈴薯塊莖StCYS1基因表達(dá)量與漿液褐變的影響圖2超表達(dá)StCYS1基因?qū)︸R鈴薯塊莖中基因表達(dá)量及漿液褐變的影響（A）WT、OE1-3馬鈴薯塊莖StCYS1基因表達(dá)量；（B）WT、OE1-3馬鈴薯塊莖漿液褐變差異。圖中不同字母代表差異性顯著（P<0.05），下同。Fig.2EffectsofoverexpressionofStCYS1geneongeneexpressionandserousBrowninginpotatotubers(A)theStCYS1geneexpressionofWTandOE1-3potatotubers,(B)differencesintuberserousbrowningofWTandOE1-3potatoes.Differentlettersinthefigurerepresentsignificantdifferences(P<0.05),thesameasbelow.圖2A是三個(gè)超表達(dá)StCYS1的二倍體馬鈴薯株系OE1-OE3和野生型WT（MDS）馬鈴薯塊莖中基因表達(dá)量測(cè)定結(jié)果。OE1-OE3的StCYS1表達(dá)量分別是WT的5.21倍、5.67倍和4.17倍，超表達(dá)三個(gè)株系的基因表達(dá)量均顯著高于WT（P<0.05），其中三個(gè)超表達(dá)株系中，OE1和OE2株系表達(dá)量較高，而OE3表達(dá)量最低。OE1-OE3和WT結(jié)薯后，挑選大小相當(dāng)、無破損的馬鈴薯塊莖去皮、液氮研磨成粉加水后觀察其漿液褐變情況。如圖1B所示，隨時(shí)間變化，WT漿液褐變程度逐漸加重，而超表達(dá)StCYS1的三個(gè)株系OE1-OE3漿液褐變程度均顯著低于WT，且三個(gè)株系中，表達(dá)量較高的兩個(gè)株系OE1、OE2褐變程度一直低于OE3。結(jié)果表明超表達(dá)StCYS1可顯著抑制馬鈴薯漿液的褐變。在此基礎(chǔ)上，我們通過測(cè)定WT和超表達(dá)株系塊莖PPO活性、抗氧化能力及游離氨基酸含量，來探討超表達(dá)StCYS1對(duì)馬鈴薯塊莖褐變的影響機(jī)制。

StCYS1基因?qū)︸R鈴薯酶促褐變及耐鹽的影響263.1.3超表達(dá)StCYS1對(duì)馬鈴薯塊莖PPO活性和抗氧化能力的影響圖3超表達(dá)StCYS1對(duì)馬鈴薯塊莖PPO活性的影響Fig.3EffectofoverexpressionofStCYS1onPPOactivityinpotatotuberPPO在有氧條件下的酶促褐變往往是導(dǎo)致鮮切加工果蔬褐變的主要原因（Gonzálezetal.,2020）。而諸多研究通過正義、反義RNA或microRNAs技術(shù)來抑制馬鈴薯PPO基因表達(dá)，以及通過物理、化學(xué)、生物的方法抑制PPO活性，均可降低馬鈴薯塊莖鮮切褐變（Chietal.,2014；張凱等，2017）。那么超表達(dá)StCYS1對(duì)馬鈴薯塊莖的PPO活性會(huì)產(chǎn)生怎樣的影響呢？結(jié)果如圖3所示，OE1和OE2酶活性分別是WT的1.41和1.36倍，均顯著高于WT(P<0.05），OE3酶活性是WT的1.08倍，并無顯著性差異。結(jié)合圖2可知，超表達(dá)StCYS1的三個(gè)馬鈴薯株系OE1-3，其塊莖漿液褐變程度均顯著低于野生型，但其中OE1和OE2馬鈴薯塊莖中PPO活性顯著高于野生型，OE3和WT無顯著差異，綜合圖2、圖3結(jié)果表明，超表達(dá)StCYS1的馬鈴薯塊莖褐變程度顯著降低，PPO活性的變化可能并不是關(guān)鍵因素，還存在其他能夠抑制褐變的要素。有研究表明，PIs的積累能夠提高馬鈴薯的抗氧化能力（Leeetal.,2016），而有關(guān)馬鈴薯鮮切褐變控制的研究中發(fā)現(xiàn)，塊莖抗氧化能力，如DPPH自由基清除率、FRAP和ABTS自由基清除率等的提高，往往會(huì)抑制鮮切褐變（范昊安等，2019；劉博文，2017），因此我們測(cè)定了WT和超表達(dá)株系的抗氧化能力，如圖4A所示，超表達(dá)株系的FRAP（鐵還原能力）、DPPH自由基清除率和ABTS自由基清除率均顯著高于野生型WT（P<0.05）。綜合比較圖4A-C結(jié)果表明，不同指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果具有一致性，三者互為印證，即StCYS1基因的超表達(dá)顯著提高了馬鈴薯塊莖的抗氧化能力。

【參考文獻(xiàn)】：
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碩士論文
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本文編號(hào)：3244104