放線菌具有豐富的次級代謝產(chǎn)物,是挖掘新型藥物的重要來源。新疆典型極端鹽堿環(huán)境蘊含著大量放線菌新物種,放線菌在適應(yīng)高鹽堿等極端環(huán)境可能演化出獨特的次級代謝產(chǎn)物,進而引起國內(nèi)外研究者的關(guān)注。本研究選擇來自新疆典型極端鹽堿環(huán)境羅布泊地區(qū)一株鏈霉菌新物種TRM49605對其進行基因簇分析,采用Red/ET重組技術(shù)對3個基因簇進行克隆和異源表達。通過異源表達,確定生物合成基因簇的生物學(xué)功能,以期獲得結(jié)構(gòu)新穎、活性較強的次級代謝產(chǎn)物,同時為后期基因改造以及組合生物學(xué)儲備基因資源。（1）羅中鏈霉菌次級代謝潛力分析為探索羅中鏈霉菌（Streptomyces luozhongensis）TRM49605次級代謝潛能,本研究對其進行全基因組測序分析,結(jié)果表明羅中鏈霉菌基因組DNA全長7 156 507 bp,通過antiSMASH分析發(fā)現(xiàn)其潛在天然產(chǎn)物生物合成基因簇有63個。為探究不同相似性基因簇異源表達情況,評估TRM49605次級代謝潛能,選取3個代表基因簇進行分析,其中,Cluster24是一個核苷類抗生素生物合成基因簇,全長29 393 bp,由26個基因組成,與衣霉素基因簇相似性為92%;基因簇... 

【文章來源】：塔里木大學(xué)新疆維吾爾自治區(qū)

【文章頁數(shù)】：91 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

基于基因組挖掘新天然產(chǎn)物策略[45]

塔里木大學(xué)碩士學(xué)位論文第1章引言9克隆技術(shù)要求極高。鏈霉菌生物合成基因簇的異源表達及生物合成相應(yīng)的次級代謝產(chǎn)物已逐漸成為發(fā)現(xiàn)新穎活性化合物的有效手段之一。TAR（transformationassociatedrecombination）克隆技術(shù)作為研究微生物次級代謝產(chǎn)物的重要工具，能夠?qū)崿F(xiàn)絕大多數(shù)基因簇的克隆及異源表達。TAR是由Natalay等人在2006年提出的大片段DNA獲得方法[57,58]，其原理是基于酵母重組系統(tǒng)，根據(jù)克隆載體兩端特異性的靶向目的基因序列從基因組中抓取目的基因簇，兩端同源臂長度一般達到60bp以上就能實現(xiàn)目的片段的選擇性捕獲。TAR克隆是目前唯一能夠特異性克隆300kb的大片段DNA的方法。同時，TAR載體還包含酵母著絲粒序列（CEN）和酵母選擇性標記(His3)，便于陽性載體在酵母細胞中的復(fù)制和篩眩TAR在酵母強大的重組體系中表現(xiàn)出較高的重組效率，其主要的優(yōu)點有（1）可從復(fù)雜基因組中選擇性分離目標DNA；（2）重組DNA片段最長可達300kb；（3）操作簡便；（4）載體特性可在酵母、大腸桿菌、放線菌中操作。TAR（transformationassociatedrecombination）克隆技術(shù)由于其獨特的優(yōu)勢近年來被廣泛應(yīng)用于微生物次級代謝產(chǎn)物生物合成基因簇的異源表達（如圖1-2），下面對通過TAR克隆所得基因簇做一匯總（如表1-2）。圖1-2基于TAR克隆的異源表達策略[59]Fig.1-2HeterologousexpressionstrategybasedonTARcloning

塔里木大學(xué)碩士學(xué)位論文第1章引言112008年，Gibson及其同事人工構(gòu)建生殖道支原體Mycoplasmagenitalium基因組，全長580kb，實現(xiàn)DNA組裝的巨大突破，提出一種無縫克隆方法GibsonAssembly又叫“Gibson恒溫一步組裝法”[67,68]。其后趙惠民[69]也開發(fā)出類似原理的組裝方式-DNA裝配器（DNAassembler），并成功獲得D-木糖代謝途徑及玉米黃質(zhì)生物合成途徑。Li等[70]將此方法進行修飾并應(yīng)用于鏈霉菌等高GC含量的次級代謝產(chǎn)物的挖掘。通過載體與外源DNA兩端相應(yīng)的同源臂在體外進行重組，此技術(shù)的巧妙之處是體外重組過程中所用的DNA核酸外切酶、DNA聚合酶、DNA連接酶可在同一溫度50℃發(fā)揮較好的活性，但其也存在一些局限性，如很難組裝小于200bp的片段，同時組裝片段數(shù)目受限等，其原理如圖1-3。Gibson組裝非常適合用于拼接多個線性DNA片段，是一種簡單、快速并且高效的DNA定向克隆技術(shù)，可將目的基因片段定向克隆至任意載體的任意位點。將載體通過PCR方式在任意位點進行線性化，并在插入片段兩端通過PCR掛載與載體末端同源的序列，使得插入片段與克隆載體具有同源序列（15bp～20bp）。然后按一定比例混合后，在DNA核酸外切酶、DNA聚合酶、DNA連接酶的催化下反應(yīng)15min即可進行轉(zhuǎn)化，完成定向克攏其后Jiang[71]等人提出進行Cas9-AssistedTargetingofCHromosomesegments（CATCH）DNA重組技術(shù)，通過Cas9蛋白切割基因組DNA獲得目的基因簇，再通過GibsonAssembly克隆目的基因簇到載體，實現(xiàn)了目的基因簇的高效獲齲圖1-3Gibson組裝原理Fig.3-1Gibsonassemblyprinciple

【參考文獻】：
期刊論文
[1]利用合成生物學(xué)技術(shù)深入挖掘放線菌中活性次級代謝產(chǎn)物[J]. 白超弦,卓英,張立新.  微生物學(xué)通報. 2013(10)
[2]基因組挖掘技術(shù)在海洋放線菌天然產(chǎn)物研究開發(fā)中的應(yīng)用及展望[J]. 陳亮宇,王玉梅,趙心清.  微生物學(xué)通報. 2013(10)
[3]海洋真菌次級代謝產(chǎn)物化學(xué)成分及生物活性的研究進展[J]. 楊加庚,梅益勤,裴月湖.  沈陽藥科大學(xué)學(xué)報. 2013(01)
[4]灰紅鏈霉菌AL7基因組文庫及異源表達文庫的構(gòu)建[J]. 劉培,俞燕飛,陶美鳳.  華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報. 2012(05)
[5]適用于鏈霉菌大片段基因組DNA克隆和異源表達的細菌人工染色體（BAC）載體的構(gòu)建及應(yīng)用[J]. 黃勝,李娜,周俊,何璟.  微生物學(xué)報. 2012(01)
[6]一株具有抗腫瘤活性的海洋放線菌的分離和鑒定[J]. 袁獻溫,楊瑞麗.  微生物學(xué)通報. 2009(01)
[7]纈氨霉素液膜傳輸Rb+跨人紅細胞膜行為的研究[J]. 王亞妮,蔣育澄,馮云曉,胡滿成,李淑妮.  化學(xué)學(xué)報. 2008(13)
[8]微生物次級代謝產(chǎn)物生物合成基因簇與藥物創(chuàng)新[J]. 白林泉,鄧子新.  中國抗生素雜志. 2006(02)
[9]放線菌——微生物藥物的重要資源[J]. 劉志恒.  微生物學(xué)通報. 2005(06)
[10]Red重組系統(tǒng)及在微生物基因敲除中的應(yīng)用[J]. 胡堃,史兆興,賽道建,黃留玉.  遺傳. 2003(05)

博士論文
[1]基于Red/ET同源重組的基因簇克隆、修飾和異源表達平臺的構(gòu)建與應(yīng)用[D]. 李振.山東大學(xué) 2019

碩士論文
[1]兩株鏈霉菌新物種的多相分類及其次生代謝產(chǎn)物研究[D]. 張仁文.塔里木大學(xué) 2016
[2]青海高原（西部）土壤放線菌資源及應(yīng)用研究[D]. 司美茹.西北農(nóng)林科技大學(xué) 2003



本文編號：3219699