油茶是我國極具食用價值和經(jīng)濟價值的木本油料樹種。油茶屬自交不親和樹種,種植時需要進行合理的品種配置。為解析油茶自交不親和的分子機制,本實驗室團隊以油茶主要栽培品種‘華鑫’和‘華金’為試驗材料,構建了自交和異交授粉后存在顯著差異的雌蕊轉錄組數(shù)據(jù)庫。通過轉錄組解析,發(fā)現(xiàn)ABC轉運蛋白代謝途徑與油茶自交不親和緊密相關,為此,本課題開展了油茶ABC轉運蛋白的基因克隆及功能研究。取得如下研究結果:1.油茶6條ABC轉運蛋白基因的克隆及生物信息學分析。從油茶自交和異交雌蕊轉錄組數(shù)據(jù)中篩選得到6條差異顯著的ABC轉運蛋白基因,設計6對特異性引物,擴增并克隆獲得具有全長的CDS基因序列;該6個基因的全長CDS序列分別為:3381 bp、2142 bp、2172 bp、1935 bp、2166 bp、3318 bp,分別編碼 1126、713、2172、644、721、1105 個氨基酸;相對分子量分別為 126.53、79.63、79.93、72.65、80.47、121.84kDa;等電點 PI 分別是 9.02、5.8、8.84、7.91、80.47、8.9;預測結果顯示分別含有13、0、6、6、... 

【文章來源】：中南林業(yè)科技大學湖南省

【文章頁數(shù)】：90 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
1 緒論
    1.1 油茶簡介
    1.2 ABC轉運蛋白簡介
        1.2.1 植物ABC轉運蛋白的結構
        1.2.2 植物ABC轉運蛋白的作用機制
        1.2.3 植物ABC轉運蛋白的分類與功能
    1.3 植物自交不親和反應簡介
    1.4 研究目的及意義
    1.5 技術路線
2 油茶ABC基因的克隆及生物信息學分析
    2.1 實驗材料
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 主要試劑
        2.1.3 主要儀器
    2.2 實驗方法
        2.2.1 油茶雌蕊總RNA的制備
        2.2.2 RNA反轉錄成cDNA
        2.2.3 油茶ABC目的基因的篩選
        2.2.4 油茶ABC基因全長引物設計
        2.2.5 目的基因的PCR擴增
        2.2.6 PCR擴增產(chǎn)物的回收
        2.2.7 PCR擴增產(chǎn)物的連接轉化
        2.2.8 陽性克隆篩選
        2.2.9 生物信息學分析
    2.3 結果與分析
        2.3.1 油茶ABC轉運蛋白家族的鑒定與分類
        2.3.2 油茶總RNA的提取
        2.3.3 油茶ABC轉運蛋白候選基因的克隆
        2.3.4 油茶ABC基因的生物信息學分析
    2.4 討論
3 油茶ABC基因的表達分析及原核表達
    3.1 實驗材料
        3.1.1 植物材料
        3.1.2 主要試劑
        3.1.3 主要儀器
    3.2 實驗方法
        3.2.1 不同組織總RNA提取及熒光定量cDNA的制備
        3.2.2 實時熒光定量和原核表達引物設計
        3.2.3 qPCR基因表達分析
        3.2.4 熒光定量數(shù)據(jù)分析
        3.2.5 Pcold-TF表達載體的制備
        3.2.6 基因表達片段的克隆
        3.2.7 基因表達載體的制備
        3.2.8 原核表達載體的構建
        3.2.9 誘導表達及SDS-PAGE電泳檢測
    3.3 結果與分析
        3.3.1 總RNA的提取
        3.3.2 qPCR特異性引物檢測
        3.3.3 油茶ABC基因在不同器官中的表達
        3.3.4 原核表達載體Pcold-TF質粒提取
        3.3.5 原核表達載體的構建
        3.3.6 油茶ABCF3的原核表達分析
    3.4 討論
4 油茶ABC基因的亞細胞定位和功能驗證
    4.1 實驗材料
        4.1.1 植物材料
        4.1.2 主要試劑
        4.1.3 主要儀器
    4.2 實驗方法
        4.2.1 亞細胞定位和真核表達引物設計
        4.2.2 目的片段和表達載體的制備
        4.2.3 載體的構建
        4.2.4 農(nóng)桿菌轉化
        4.2.5 亞細胞定位表達載體轉化至煙草
        4.2.6 野生型擬南芥的種植
        4.2.7 真核表達載體轉化至擬南芥
        4.2.8 轉基因擬南芥的篩選
        4.2.9 轉基因擬南芥的表型觀察
        4.2.10 轉基因植株可溶性糖含量的測定
    4.3 結果與分析
        4.3.1 表達載體的構建
        4.3.2 PCR鑒定農(nóng)桿菌陽性菌液
        4.3.3 油茶ABC基因的亞細胞定位
        4.3.4 轉基因擬南芥的獲得及陽性植株鑒定
        4.3.5 轉基因擬南芥的表型分析
        4.3.6 轉基因植株的可溶性糖含量分析
    4.4 討論
5 結論、創(chuàng)新點與展望
    5.1 結論
    5.2 創(chuàng)新點
    5.3 研究展望
參考文獻
附錄A 常用實驗藥品配方
附錄B 攻讀碩士學位期間的主要學術成果
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
[1]油茶產(chǎn)業(yè)發(fā)展新論[J]. 陳永忠,鄧紹宏,陳隆升,馬力,何宏,王湘南,彭邵鋒,劉彩霞,王瑞,許彥明,張震.  南京林業(yè)大學學報(自然科學版). 2020(01)
[2]月季RhATAF1基因的克隆及表達特性分析[J]. 丁愛琴,李紹翠,劉慶超,王奎玲,李偉,劉慶華,姜新強.  植物生理學報. 2018(11)
[3]紅外光譜快速測定油茶籽油中主要功能活性成分含量的模型建立與評價[J]. 吳雪輝,王澤富.  中國油脂. 2018(10)
[4]ABC轉運蛋白與人類疾病[J]. 侯文韜,王亮,徐達,陳宇星,周叢照.  中國科學技術大學學報. 2018(10)
[5]梨自交不親和性反應S-RNase新靶點——微絲骨架[J]. 吳巨友,李啟明,王鵬,張紹鈴.  南京農(nóng)業(yè)大學學報. 2018(05)
[6]“十二五”期間我國油茶產(chǎn)業(yè)發(fā)展特征分析[J]. 丁松,潘鵬,張邦文,韓天一,金蘇蓉,肖欣,黎芳.  福建林業(yè)科技. 2018(03)
[7]油茶種植技術措施與油茶作物發(fā)展前景[J]. 鐘明順.  農(nóng)業(yè)與技術. 2018(17)
[8]油茶良種化的現(xiàn)狀及發(fā)展對策分析[J]. 鄧發(fā)生.  南方農(nóng)業(yè). 2018(26)
[9]鐵皮石斛自交和雜交親和性的細胞學研究[J]. 高楊,林韌安,袁超群,馬麗婭,王佳囡,朱玉球,高燕會.  浙江農(nóng)林大學學報. 2018(04)
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博士論文
[1]油茶后期自交不親和性的細胞學研究[D]. 高超.中南林業(yè)科技大學 2017
[2]茶樹育性相關基因的克隆與表達研究[D]. 張成才.華中農(nóng)業(yè)大學 2017
[3]基于蛋白組學的甘藍自交不親和性相關新基因的克隆與功能探索[D]. 曾靜.西南大學 2017
[4]蘋果MdABCF轉運S-RNase至花粉管影響自交不親和反應[D]. 孟冬.中國農(nóng)業(yè)大學 2014
[5]煙草ABC轉運蛋白家族鑒定及次生代謝物質轉運的功能研究[D]. 謝小東.重慶大學 2014
[6]油茶種仁糖酵解途徑解析及醛縮酶基因家族功能研究[D]. 曾艷玲.中南林業(yè)科技大學 2013
[7]油茶種子發(fā)育過程組分及脂類代謝相關基因表達變化研究[D]. 周長富.中國林業(yè)科學研究院 2013
[8]茶樹自交不親和類型的鑒定及相關基因克隆與表達分析[D]. 陳暄.南京農(nóng)業(yè)大學 2010

碩士論文
[1]苦蕎ABC轉運蛋白基因的克隆與功能初步分析[D]. 李潔.西北農(nóng)林科技大學 2018
[2]柚ABC基因的篩選、克隆及其表達研究[D]. 宋敏娜.福建農(nóng)林大學 2018
[3]岷江百合LrABCF1基因的克隆及功能驗證[D]. 李紹華.西北農(nóng)林科技大學 2017
[4]油桐長鏈脂酰輔酶A合成酶基因的克隆與功能表達研究[D]. 呂佳斌.中南林業(yè)科技大學 2017
[5]光皮樺BlKNOX家族基因表達及互作機制分析[D]. 趙傳慧.浙江農(nóng)林大學 2014
[6]油茶自交不親和性初步研究[D]. 廖婷.中南林業(yè)科技大學 2013
[7]湖南省油茶產(chǎn)業(yè)化發(fā)展策略研究[D]. 周琳.湖南農(nóng)業(yè)大學 2012



本文編號：3206618