油茶是我國極具食用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值的木本油料樹種。油茶屬自交不親和樹種,種植時(shí)需要進(jìn)行合理的品種配置。為解析油茶自交不親和的分子機(jī)制,本實(shí)驗(yàn)室團(tuán)隊(duì)以油茶主要栽培品種‘華鑫’和‘華金’為試驗(yàn)材料,構(gòu)建了自交和異交授粉后存在顯著差異的雌蕊轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫。通過轉(zhuǎn)錄組解析,發(fā)現(xiàn)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白代謝途徑與油茶自交不親和緊密相關(guān),為此,本課題開展了油茶ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因克隆及功能研究。取得如下研究結(jié)果:1.油茶6條ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的克隆及生物信息學(xué)分析。從油茶自交和異交雌蕊轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選得到6條差異顯著的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因,設(shè)計(jì)6對特異性引物,擴(kuò)增并克隆獲得具有全長的CDS基因序列;該6個(gè)基因的全長CDS序列分別為:3381 bp、2142 bp、2172 bp、1935 bp、2166 bp、3318 bp,分別編碼 1126、713、2172、644、721、1105 個(gè)氨基酸;相對分子量分別為 126.53、79.63、79.93、72.65、80.47、121.84kDa;等電點(diǎn) PI 分別是 9.02、5.8、8.84、7.91、80.47、8.9;預(yù)測結(jié)果顯示分別含有13、0、6、6、... 

【文章來源】：中南林業(yè)科技大學(xué)湖南省

【文章頁數(shù)】：90 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
1 緒論
    1.1 油茶簡介
    1.2 ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白簡介
        1.2.1 植物ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的結(jié)構(gòu)
        1.2.2 植物ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的作用機(jī)制
        1.2.3 植物ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的分類與功能
    1.3 植物自交不親和反應(yīng)簡介
    1.4 研究目的及意義
    1.5 技術(shù)路線
2 油茶ABC基因的克隆及生物信息學(xué)分析
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 主要試劑
        2.1.3 主要儀器
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 油茶雌蕊總RNA的制備
        2.2.2 RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA
        2.2.3 油茶ABC目的基因的篩選
        2.2.4 油茶ABC基因全長引物設(shè)計(jì)
        2.2.5 目的基因的PCR擴(kuò)增
        2.2.6 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的回收
        2.2.7 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的連接轉(zhuǎn)化
        2.2.8 陽性克隆篩選
        2.2.9 生物信息學(xué)分析
    2.3 結(jié)果與分析
        2.3.1 油茶ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的鑒定與分類
        2.3.2 油茶總RNA的提取
        2.3.3 油茶ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白候選基因的克隆
        2.3.4 油茶ABC基因的生物信息學(xué)分析
    2.4 討論
3 油茶ABC基因的表達(dá)分析及原核表達(dá)
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.1 植物材料
        3.1.2 主要試劑
        3.1.3 主要儀器
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 不同組織總RNA提取及熒光定量cDNA的制備
        3.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量和原核表達(dá)引物設(shè)計(jì)
        3.2.3 qPCR基因表達(dá)分析
        3.2.4 熒光定量數(shù)據(jù)分析
        3.2.5 Pcold-TF表達(dá)載體的制備
        3.2.6 基因表達(dá)片段的克隆
        3.2.7 基因表達(dá)載體的制備
        3.2.8 原核表達(dá)載體的構(gòu)建
        3.2.9 誘導(dǎo)表達(dá)及SDS-PAGE電泳檢測
    3.3 結(jié)果與分析
        3.3.1 總RNA的提取
        3.3.2 qPCR特異性引物檢測
        3.3.3 油茶ABC基因在不同器官中的表達(dá)
        3.3.4 原核表達(dá)載體Pcold-TF質(zhì)粒提取
        3.3.5 原核表達(dá)載體的構(gòu)建
        3.3.6 油茶ABCF3的原核表達(dá)分析
    3.4 討論
4 油茶ABC基因的亞細(xì)胞定位和功能驗(yàn)證
    4.1 實(shí)驗(yàn)材料
        4.1.1 植物材料
        4.1.2 主要試劑
        4.1.3 主要儀器
    4.2 實(shí)驗(yàn)方法
        4.2.1 亞細(xì)胞定位和真核表達(dá)引物設(shè)計(jì)
        4.2.2 目的片段和表達(dá)載體的制備
        4.2.3 載體的構(gòu)建
        4.2.4 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化
        4.2.5 亞細(xì)胞定位表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至煙草
        4.2.6 野生型擬南芥的種植
        4.2.7 真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至擬南芥
        4.2.8 轉(zhuǎn)基因擬南芥的篩選
        4.2.9 轉(zhuǎn)基因擬南芥的表型觀察
        4.2.10 轉(zhuǎn)基因植株可溶性糖含量的測定
    4.3 結(jié)果與分析
        4.3.1 表達(dá)載體的構(gòu)建
        4.3.2 PCR鑒定農(nóng)桿菌陽性菌液
        4.3.3 油茶ABC基因的亞細(xì)胞定位
        4.3.4 轉(zhuǎn)基因擬南芥的獲得及陽性植株鑒定
        4.3.5 轉(zhuǎn)基因擬南芥的表型分析
        4.3.6 轉(zhuǎn)基因植株的可溶性糖含量分析
    4.4 討論
5 結(jié)論、創(chuàng)新點(diǎn)與展望
    5.1 結(jié)論
    5.2 創(chuàng)新點(diǎn)
    5.3 研究展望
參考文獻(xiàn)
附錄A 常用實(shí)驗(yàn)藥品配方
附錄B 攻讀碩士學(xué)位期間的主要學(xué)術(shù)成果
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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博士論文
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[3]基于蛋白組學(xué)的甘藍(lán)自交不親和性相關(guān)新基因的克隆與功能探索[D]. 曾靜.西南大學(xué) 2017
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碩士論文
[1]苦蕎ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的克隆與功能初步分析[D]. 李潔.西北農(nóng)林科技大學(xué) 2018
[2]柚ABC基因的篩選、克隆及其表達(dá)研究[D]. 宋敏娜.福建農(nóng)林大學(xué) 2018
[3]岷江百合LrABCF1基因的克隆及功能驗(yàn)證[D]. 李紹華.西北農(nóng)林科技大學(xué) 2017
[4]油桐長鏈脂酰輔酶A合成酶基因的克隆與功能表達(dá)研究[D]. 呂佳斌.中南林業(yè)科技大學(xué) 2017
[5]光皮樺BlKNOX家族基因表達(dá)及互作機(jī)制分析[D]. 趙傳慧.浙江農(nóng)林大學(xué) 2014
[6]油茶自交不親和性初步研究[D]. 廖婷.中南林業(yè)科技大學(xué) 2013
[7]湖南省油茶產(chǎn)業(yè)化發(fā)展策略研究[D]. 周琳.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 2012



本文編號：3206618