水稻是重要的糧食作物,稻瘟病是影響水稻產(chǎn)量的三大病害之首,嚴(yán)重影響水稻產(chǎn)量。研究稻瘟病抗性基因,進(jìn)行抗病育種是目前防治稻瘟病最經(jīng)濟(jì)有效的方法。由于稻瘟病菌種的變異和多樣性,抗性品種在種植幾年后往往會失去對稻瘟病的抗性,因此挖掘新的抗性基因至關(guān)重要。稻瘟病新抗性基因Pi39來源于云南當(dāng)?shù)仄贩NQ15,經(jīng)抗譜檢測具有廣譜抗性,前期已經(jīng)構(gòu)建了Pi39的物理圖譜,并構(gòu)建了10個(gè)候選基因的功能互補(bǔ)載體,同時(shí)進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化,得到轉(zhuǎn)基因植株,本研究主要是克隆了另2個(gè)候選基因并進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化,然后對所有候選基因的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行了分子鑒定和稻瘟病抗性鑒定,主要內(nèi)容如下:（1）利用長片段PCR擴(kuò)增和平末端連接的方法,構(gòu)建了1300-Pi39C和1300-Pi39E功能互補(bǔ)載體,并進(jìn)行水稻遺傳轉(zhuǎn)化,得到轉(zhuǎn)基因植株,通過陽性鑒定獲得轉(zhuǎn)基因陽性植株,其中Pi39C已獲得18株轉(zhuǎn)基因陽性苗,Pi39E已獲得44株轉(zhuǎn)基因陽性苗。（2）對12個(gè)候選基因的功能互補(bǔ)的轉(zhuǎn)基因T₁代植株進(jìn)行陽性鑒定,得到陽性苗,分別進(jìn)行離體接種和活體接種,觀察表型,篩選出候選基因Pi39E₁即為抗性基因... 

【文章來源】：中南民族大學(xué)湖北省

【文章頁數(shù)】：83 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 稻瘟病抗性基因研究意義
    1.2 稻瘟病抗性基因定位與克隆
    1.3 稻瘟病抗性機(jī)理
    1.4 研究內(nèi)容及意義
第二章 Pi39候選基因1300-Pi39C和1300-Pi39E的克隆及遺傳轉(zhuǎn)化
    2.1 前言
    2.2 實(shí)驗(yàn)材料
        2.2.1 水稻品種
        2.2.2 菌株
        2.2.3 載體
        2.2.4 質(zhì)粒
        2.2.5 試劑及配方
            2.2.5.1 實(shí)驗(yàn)試劑
            2.2.5.2 主要培養(yǎng)基及配方
        2.2.6 儀器設(shè)備
    2.3 實(shí)驗(yàn)方法
        2.3.1 1300-Pi39C載體構(gòu)建
            2.3.1.1 候選基因擴(kuò)增引物
            2.3.1.2 Pi39C基因的擴(kuò)增
            2.3.1.3 目的片段的酶切及回收
            2.3.1.4 pCAMBIA1300AscI和pCAMBIA1301 載體質(zhì)粒DNA的制備
            2.3.1.5 載體質(zhì)粒的酶切及去磷酸化
            2.3.1.6 目的片段與載體的連接
            2.3.1.7 連接產(chǎn)物熱擊轉(zhuǎn)化Top10感受態(tài)細(xì)胞
            2.3.1.8 陽性克隆的鑒定
        2.3.2 候選基因陽性克隆電擊轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌
        2.3.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的Pi39E和Pi39C水稻遺傳轉(zhuǎn)化
            2.3.3.1 水稻愈傷組織的誘導(dǎo)
            2.3.3.2 水稻愈傷組織的預(yù)培養(yǎng)
            2.3.3.3 農(nóng)桿菌的活化
            2.3.3.4 愈傷組織侵染及共培養(yǎng)
            2.3.3.5 愈傷組織的篩選
            2.3.3.6 愈傷組織的分化
            2.3.3.7 幼苗的生根及移栽
        2.3.4 轉(zhuǎn)基因T_0代植株的陽性鑒定
            2.3.4.1 轉(zhuǎn)基因苗基因組DNA的提取
            2.3.4.2 轉(zhuǎn)基因植株陽性鑒定
    2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        2.4.1 Pi39C目的片段的擴(kuò)增和Pi39E目的片段的酶切及回收
        2.4.2 pCAMBIA1300AscI和pCAMBIA1301載體質(zhì)粒DNA的酶切及去磷酸化
        2.4.3 單克隆菌落PCR檢測
        2.4.4 單克隆質(zhì)粒DNA酶切檢測
        2.4.5 1300-Pi39E和1300-Pi39C的遺傳轉(zhuǎn)化
        2.4.6 Pi39C轉(zhuǎn)基因植株T_0代陽性鑒定
        2.4.7 Pi39E轉(zhuǎn)基因植株T_0代陽性鑒定
    2.5 討論
第三章 Pi39候選基因功能互補(bǔ)轉(zhuǎn)基因植株的分子鑒定與抗病性分析
    3.1 前言
    3.2 實(shí)驗(yàn)材料
        3.2.1 水稻品種和稻瘟病菌種
        3.2.2 主要試劑
        3.2.3 主要儀器設(shè)備
        3.2.4 引物與PCR程序
    3.3 實(shí)驗(yàn)方法
        3.3.1 材料的準(zhǔn)備
            3.3.1.1 水稻品種
            3.3.1.2 水稻幼苗的栽培
            3.3.1.3 候選基因功能互補(bǔ)T_1代轉(zhuǎn)基因幼苗的陽性鑒定
                3.3.1.3.1 幼苗基因組DNA的提取
                3.3.1.3.2 幼苗陽性鑒定
        3.3.2 稻瘟病菌離體接種
            3.3.2.1 稻瘟病菌的活化及產(chǎn)孢
            3.3.2.2 水稻葉片的處理
            3.3.2.3 離體接種
        3.3.3 稻瘟病菌活體接種
            3.3.3.1 稻瘟病菌的活化及產(chǎn)孢
            3.3.3.2 活體接種
    3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.4.1 候選基因功能互補(bǔ)T_1代轉(zhuǎn)基因幼苗的陽性鑒定
            3.4.1.1 Pi39A轉(zhuǎn)基因植株T_1代陽性鑒定
            3.4.1.2 Pi39B轉(zhuǎn)基因植株T_1代陽性鑒定
            3.4.1.3 其他幾個(gè)候選基因植株T_1代陽性鑒定
        3.4.2 候選基因功能互補(bǔ)轉(zhuǎn)基因植株離體接種
        3.4.3 候選基因功能互補(bǔ)轉(zhuǎn)基因植株活體接種
    3.5 討論
第四章 Pi39E_1RNAi載體的構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化
    4.1 前言
    4.2 材料與方法
        4.2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        4.2.2 實(shí)驗(yàn)試劑及培養(yǎng)基
            4.2.2.1 主要試劑
            4.2.2.2 主要培養(yǎng)基及配方
    4.3 實(shí)驗(yàn)方法
        4.3.1 植物干涉表達(dá)載體構(gòu)建
            4.3.1.1 水稻Q15葉片總RNA的提取
            4.3.1.2 合成Q15 cDNA第一鏈
            4.3.1.3 Q15 cDNA actin檢測
            4.3.1.4 Pi39E_1RNAi表達(dá)載體構(gòu)建
                4.3.1.4.1 Pi39E_1RNAi目的片段的擴(kuò)增
                4.3.1.4.2 Pi39E_1RNAi目的片段和空載ds1301雙酶切及回收
                4.3.1.4.3 酶切產(chǎn)物的連接及轉(zhuǎn)化
                4.3.1.4.4 第一鏈插入的中間載體陽性克隆鑒定
                4.3.1.4.5 第二鏈和中間載體雙酶切及回收
                4.3.1.4.6 第二鏈連接中間載體及轉(zhuǎn)化
                4.3.1.4.7 Pi39E_1-ds1301重組質(zhì)粒雙酶切鑒定
        4.3.2 Pi39E_1RNAi表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌
        4.3.3 Pi39E_1RNAi載體的遺傳轉(zhuǎn)化
        4.3.4 Pi39E_1RNAi轉(zhuǎn)基因植株T_0代陽性鑒定
    4.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        4.4.1 Q15 cDNA actin檢測
        4.4.2 Pi39E_1RNAi目的片段的擴(kuò)增
        4.4.3 ds1301載體質(zhì)粒DNA的BamH I和Asc I雙酶切檢測
        4.4.4 中間載體單克隆菌落PCR檢測
        4.4.5 中間載體單克隆質(zhì)粒DNA酶切檢測
        4.4.6 Pi39E_1RNAi單克隆菌落PCR檢測
        4.4.7 Pi39E_1RNAi單克隆質(zhì)粒DNA酶切檢測
        4.4.8 Pi39E_1RNAi單克隆農(nóng)桿菌菌落PCR檢測
        4.4.9 Pi39E_1RNAi的遺傳轉(zhuǎn)化
    4.5 討論
第五章 Pi39E_1的表達(dá)量分析
    5.1 前言
    5.2 實(shí)驗(yàn)材料
        5.2.1 水稻種子和稻瘟病菌
        5.2.2 主要儀器設(shè)備
        5.2.3 主要試劑
    5.3 實(shí)驗(yàn)方法
        5.3.1 日本晴和Q15種子的無菌發(fā)芽
        5.3.2 日本晴和Q15葉片的離體接種
        5.3.3 RNA的提取、反轉(zhuǎn)錄和actin檢測
        5.3.4 接種后不同時(shí)期Pi39E_1基因的表達(dá)量檢測
    5.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        5.4.1 cDNA質(zhì)量檢測
        5.4.2 接種稻瘟病菌后不同時(shí)期Pi39E_1基因的表達(dá)量檢測
    5.5 討論
第六章 Pi39E_1亞細(xì)胞定位的研究
    6.1 前言
    6.2 實(shí)驗(yàn)材料、試劑及儀器
        6.2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        6.2.2 實(shí)驗(yàn)試劑
            6.2.2.1 相關(guān)試劑
            6.2.2.2 水稻黃化苗培養(yǎng)基
        6.2.3 實(shí)驗(yàn)儀器
    6.3 實(shí)驗(yàn)方法
        6.3.1 pM999-Pi39E_1-GFP亞細(xì)胞定位載體的構(gòu)建
            6.3.1.1 pM999-Pi39E_1-GFP亞細(xì)胞載體擴(kuò)增引物
            6.3.1.2 Pi39E_1目的片段的擴(kuò)增
            6.3.1.3 目的片段酶切及回收
            6.3.1.4 pM999-GFP空載體的雙酶切及回收
            6.3.1.5 目的片段與載體連接
            6.3.1.6 連接產(chǎn)物熱擊轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞
            6.3.1.7 pM999-Pi39E_1-GFP陽性克隆的鑒定
        6.3.2 水稻黃化苗原生質(zhì)體的制備及轉(zhuǎn)化
    6.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        6.4.1 Pi39E_1cDNA目的片段的擴(kuò)增
        6.4.2 pM999-GFP載體DNA酶切
        6.4.3 單克隆菌落PCR檢測
        6.4.4 單克隆質(zhì)粒DNA酶切檢測
    6.5 討論
參考文獻(xiàn)
致謝
在讀期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文
參與的科研課題
參與的學(xué)術(shù)會議


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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博士論文
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本文編號：3206389