本文關(guān)鍵詞：新型內(nèi)切-β-葡聚糖酶基因在里氏木霉中的重組與表達(dá)，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：作為纖維素復(fù)合酶系的重要組成部分,內(nèi)切-β-葡聚糖酶在可再生纖維素資源的生物轉(zhuǎn)化與利用、棉織物生物整理、制漿造紙以及輕工食品等領(lǐng)域中應(yīng)用廣泛。目前常用的纖維素酶生產(chǎn)菌種里氏木霉(Trichoderma reesei)所產(chǎn)的內(nèi)切-p-葡聚糖酶僅適用于酸性反應(yīng)體系,其應(yīng)用范圍受到了很大的限制。采用基因工程技術(shù),構(gòu)建新型內(nèi)切-p-葡聚糖酶高產(chǎn)菌株,對(duì)于纖維素酶制劑的工業(yè)化應(yīng)用具有重要的推動(dòng)作用。刺糙青霉(Penicillium echinulatum)可產(chǎn)生一種耐熱、耐堿的內(nèi)切-p-葡聚糖酶,具有重要的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值,但野生型刺糙青霉的產(chǎn)酶水平很低,難以實(shí)現(xiàn)規(guī)�；a(chǎn)。本文以刺糙青霉的內(nèi)切-p-葡聚糖酶基因(Egll)為研究對(duì)象,首先對(duì)其進(jìn)行密碼子優(yōu)化,獲得符合里氏木霉密碼子偏好的新型內(nèi)切-p-葡聚糖酶基因Eglln,該基因全長(zhǎng)1175 bp,編碼含387個(gè)氨基酸的成熟肽。之后將該基因置于里氏木霉強(qiáng)啟動(dòng)子Pcbhl(纖維二糖水解酶Ⅰ)及其信號(hào)肽和終止子Tcbhl(維二糖水解酶Ⅰ)之間,以pCAMBIA1300為載體骨架構(gòu)建重組質(zhì)粒pCB-PET,該質(zhì)粒同時(shí)含有目的基因Eglln和潮霉素篩選標(biāo)記。采用根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化技術(shù)將重組質(zhì)粒pCB-PET導(dǎo)入里氏木霉的分生孢子中,在潮霉素抗性平板上篩選獲得226個(gè)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子,進(jìn)一步通過(guò)復(fù)篩獲得5個(gè)優(yōu)良的重組轉(zhuǎn)化子。將5個(gè)轉(zhuǎn)化子重復(fù)傳代培養(yǎng)10個(gè)批次后,分別提取染色體DNA進(jìn)行PCR驗(yàn)證,均可檢測(cè)到目的基因Eglln條帶,說(shuō)明該基因已穩(wěn)定地整合到里氏木霉基因組中。采用SDS-PAGE蛋白電泳對(duì)轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)液進(jìn)行檢測(cè),獲得了與目的基因表達(dá)產(chǎn)物相符的蛋白條帶(約41 kDa),表明Eglln已在重組里氏木霉中成功實(shí)現(xiàn)了胞外表達(dá)。重組轉(zhuǎn)化子在30℃,搖瓶轉(zhuǎn)速200 r/min條件下培養(yǎng)48 h,取發(fā)酵上清液在pH8.0,60℃條件下檢測(cè),內(nèi)切-p-葡聚糖酶活力可高達(dá)382.6 U/ml,為宿主菌株的22.5倍。采用分批發(fā)酵工藝,在2 m3發(fā)酵罐中對(duì)重組轉(zhuǎn)化子T1進(jìn)行產(chǎn)酶試驗(yàn),其堿性?xún)?nèi)切-p-葡聚糖酶活力在96 h可達(dá)到1070 U/ml,為搖瓶條件下的2.8倍。表明發(fā)酵罐條件下溶氧、攪拌的改善有利于目的基因在重組轉(zhuǎn)化子中的高效表達(dá)。酶學(xué)性質(zhì)研究結(jié)果表明：該酶耐熱性能較好,在70℃以下性能穩(wěn)定,其最適催化溫度為60℃；該酶在pH 5.0-10.5范圍內(nèi)穩(wěn)定性較好、具有明顯的催化活性,其最適pH為8.0,屬于堿性纖維素酶。Ca2+對(duì)重組內(nèi)切-p-葡聚糖酶有明顯的激活作用,而Hg2+、Mg2+、Al3+、zn3+、Cu2+.和Fe3+在一定程度減弱酶的催化作用,其中Hg2+可以完全抑制重組內(nèi)切-p-葡聚糖酶活性。本文成功地實(shí)現(xiàn)了刺糙青霉內(nèi)切-p-葡聚糖酶基因在里氏木霉中的重組與胞外表達(dá),有關(guān)研究結(jié)果在里氏木霉纖維素酶的定向進(jìn)化以及內(nèi)切-p-葡聚糖酶的工業(yè)化應(yīng)用方面具有重要的促進(jìn)作用。
【關(guān)鍵詞】：內(nèi)切-β-葡聚糖酶 堿性纖維素酶 里氏木霉 基因克隆 基因重組 表達(dá)
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：Q78
【目錄】：

• 致謝5-6
• 摘要6-8
• Abstract8-13
• 1 緒論13-29
• 1.1 引言13
• 1.2 纖維素酶概述13-20
• 1.2.1 纖維素酶酶系組成13-14
• 1.2.2 纖維素酶的結(jié)構(gòu)14-15
• 1.2.3 纖維素酶的作用機(jī)理15-17
• 1.2.4 纖維素酶的主要來(lái)源17
• 1.2.5 里氏木霉產(chǎn)纖維素酶概述17-20
• 1.2.6 青霉產(chǎn)纖維素酶概述20
• 1.3 纖維素酶活力測(cè)定20-21
• 1.4 纖維素酶的應(yīng)用21-24
• 1.4.1 在廢紙脫墨中的應(yīng)用21-22
• 1.4.2 在紡織印染工業(yè)中的應(yīng)用22-23
• 1.4.3 在生物質(zhì)酒精工業(yè)中的應(yīng)用23-24
• 1.5 絲狀真菌表達(dá)體系24-27
• 1.5.1 轉(zhuǎn)化方法24-25
• 1.5.2 絲狀真菌遺傳轉(zhuǎn)化的選擇標(biāo)記25-26
• 1.5.3 絲狀真菌表達(dá)體系研究現(xiàn)狀26-27
• 1.6 本課題的研究思路和主要內(nèi)容27-29
• 2 重組內(nèi)切-β-葡聚糖酶基因Egl1n在里氏木霉中的表達(dá)29-50
• 2.1 引言29
• 2.2 材料與方法29-40
• 2.2.1 材料與試劑29-31
• 2.2.2 培養(yǎng)基31-32
• 2.2.3 實(shí)驗(yàn)儀器32
• 2.2.4 實(shí)驗(yàn)方法32-40
• 2.3 結(jié)果與討論40-48
• 2.3.1 重組內(nèi)切-β-葡聚糖酶基因Egl1n的獲得40-41
• 2.3.2 重組載體的構(gòu)建41-42
• 2.3.3 重組載體的驗(yàn)證分析42-44
• 2.3.4 Egl1n基因的序列分析44-45
• 2.3.5 根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化45
• 2.3.6 重組里氏木霉轉(zhuǎn)化子的篩選45-46
• 2.3.7 重組里氏木霉PCR驗(yàn)證46-47
• 2.3.8 重組里氏木霉發(fā)酵液的蛋白質(zhì)電泳檢測(cè)47-48
• 2.4 小結(jié)48-50
• 3 重組里氏木霉產(chǎn)酶實(shí)驗(yàn)50-58
• 3.1 引言50
• 3.2 材料與方法50-53
• 3.2.1 材料與試劑50-51
• 3.2.2 培養(yǎng)基51-52
• 3.2.3 實(shí)驗(yàn)儀器52
• 3.2.4 實(shí)驗(yàn)方法52-53
• 3.3 結(jié)果與討論53-56
• 3.3.1 重組里氏木霉搖瓶產(chǎn)酶結(jié)果53-54
• 3.3.2 重組里氏木霉搖瓶發(fā)酵的產(chǎn)酶進(jìn)程54-55
• 3.3.3 發(fā)酵罐分批發(fā)酵試驗(yàn)55-56
• 3.4 小結(jié)56-58
• 4 重組內(nèi)切-β-葡聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)研究58-69
• 4.1 引言58
• 4.2 材料與方法58-63
• 4.2.1 材料和試劑58-60
• 4.2.2 培養(yǎng)基60-61
• 4.2.3 實(shí)驗(yàn)儀器61
• 4.2.4 實(shí)驗(yàn)方法61-63
• 4.3 結(jié)果與討論63-67
• 4.3.1 溫度對(duì)重組內(nèi)切-β-葡聚糖酶活性的影響63
• 4.3.2 溫度對(duì)重組內(nèi)切-β-葡聚糖酶穩(wěn)定性的影響63-64
• 4.3.3 pH對(duì)重組內(nèi)切-β-葡聚糖酶活性的影響64-65
• 4.3.4 pH對(duì)重組內(nèi)切-β-葡聚糖酶穩(wěn)定性的影響65-66
• 4.3.5 金屬離子對(duì)重組內(nèi)切-β-葡聚糖酶的影響66-67
• 4.3.6 重組內(nèi)切-β-葡聚糖酶穩(wěn)定性試驗(yàn)性67
• 4.4 小結(jié)67-69
• 5 結(jié)論與展望69-72
• 5.1 結(jié)論69-70
• 5.1.1 目的基因Egl1n的獲取與重組載體的構(gòu)建69
• 5.1.2 根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化與重組轉(zhuǎn)化子的篩選驗(yàn)證69-70
• 5.1.3 重組里氏木霉的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)70
• 5.1.4 重組內(nèi)切-β-葡聚糖的酶學(xué)性質(zhì)研究70
• 5.2 展望70-72
• 參考文獻(xiàn)72-81
• 附錄：論文發(fā)表情況81

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4 丁少軍;宋美靜;楊紅軍;邢增濤;周蕊;曹杰;;中性?xún)?nèi)切型纖維素酶在畢赤酵母中高水平表達(dá)的研究[J];生物工程學(xué)報(bào);2006年01期

5 馮碧薇;張賡;李?lèi)?袁漢英;呂紅;;內(nèi)切菊粉酶基因在畢赤酵母中的高水平表達(dá)研究[J];復(fù)旦學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2012年01期

6 李丹;蔣彥;;纖維素內(nèi)切酶Ⅲ再折疊過(guò)程中存在中間體(英文)[J];四川大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2012年02期

7 呂志佳;宮璐嬋;馬忠友;吳萍;王余業(yè);;黑曲霉內(nèi)切β-木聚糖酶三維結(jié)構(gòu)模建及分子進(jìn)化分析[J];安徽農(nóng)學(xué)通報(bào)(上半月刊);2010年23期

8 陳雄;內(nèi)切型菊粉酶高活力菌株的篩選[J];湖北農(nóng)業(yè)科學(xué);2003年03期

9 陳振明,王政逸,郭澤建,林福呈,李德葆;綠色木霉內(nèi)切幾丁質(zhì)酶基因的克隆及其毛殼菌轉(zhuǎn)化[J];菌物系統(tǒng);2002年03期

10 鄒永龍,桑月嬋,彭建新,王國(guó)強(qiáng);β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶的分離純化及其性質(zhì)[J];植物學(xué)報(bào);1999年11期

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1 周烈;吳小鋒;劉建新;;家蠶生物反應(yīng)器生產(chǎn)重組里氏木霉內(nèi)切-β-葡聚糖酶Ⅱ及其生物活性分析[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)分會(huì)第十次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2008年

2 楚敏;楊紅梅;婁愷;;內(nèi)切葡聚糖苷酶CelG基因在大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的表達(dá)[A];第三屆全國(guó)化學(xué)工程與生物化工年會(huì)論文摘要集（上）[C];2006年

3 劉志良;;關(guān)于講授“圓弧連接”的幾點(diǎn)看法[A];面向21世紀(jì)的圖學(xué)教育——第十二屆全國(guó)圖學(xué)教育研討會(huì)暨第三屆制圖CAI課件演示交流會(huì)論文集[C];2000年

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6 孟楠;內(nèi)切型-β-葡聚糖酶基因的表達(dá)[D];浙江大學(xué);2011年

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10 李兵;內(nèi)切纖維素酶EGⅢ在畢赤氏酵母中的表達(dá)及其吸附催化動(dòng)力學(xué)研究[D];山東大學(xué);2005年

  本文關(guān)鍵詞：新型內(nèi)切-β-葡聚糖酶基因在里氏木霉中的重組與表達(dá)，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：320334