目的利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建Nedd4基因敲除骨髓衍生巨噬細胞系（BMDM）,為研究Nedd4在巨噬細胞中的作用和機制奠定基礎。方法利用在線軟件篩選了評分較高的3個針對Nedd4基因的單向?qū)NA（sgRNA）,然后將合成的sgRNA序列插入到PX330質(zhì)粒中;將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BMDM細胞,通過有限稀釋法獲取單克隆,采用Western印跡檢測單克隆細胞中NEDD4蛋白水平;通過序列測定確認單克隆細胞的DNA序列。結(jié)果通過Western印跡檢測獲取1株NEDD4蛋白缺失的BMDM細胞;測序結(jié)果表明該細胞系中Nedd4基因發(fā)生了16bp的缺失突變。結(jié)論利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建的Nedd4敲除BMDM細胞系將成為研究Nedd4在巨噬細胞中的功能和機制的有力工具。 

【文章來源】：軍事醫(yī)學. 2017,41(04)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：4 頁

【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 材料
        1.1.1 細胞系和質(zhì)粒
        1.1.2 實驗試劑
    1.2 方法
        1.2.1 sgRNA的設計和寡核苷酸鏈的合成
        1.2.2 載體構(gòu)建
        1.2.3 細胞轉(zhuǎn)染
        1.2.4 Nedd4完全敲除細胞的篩選
2 結(jié)果
    2.1 PX330-Nedd4-sgRNA載體的構(gòu)建
    2.2 PX330-Nedd4-sgRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BMDM細胞
    2.3 穩(wěn)定敲除Nedd4的BMDM細胞株篩選
3 討論



本文編號：3183751