木材是維管形成層分化產(chǎn)生的次生木質(zhì)部不斷沉積、累加的結(jié)果。轉(zhuǎn)錄因子在木材形成過程中發(fā)揮著關(guān)鍵調(diào)控作用。在前期研究工作中,本實(shí)驗(yàn)室篩選出87個(gè)毛果楊（Populus tichocarpa）維管形成層表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子基因。這些轉(zhuǎn)錄因子可能參與調(diào)控木材形成。本研究聚焦VCS2（Vascular Cambium Specific2）轉(zhuǎn)錄因子基因,解析了其在木材形成中的調(diào)控功能。本研究首先構(gòu)建PtrVCS2融合GFP蛋白的瞬時(shí)表達(dá)載體,并利用毛果楊木質(zhì)部原生質(zhì)體系統(tǒng)進(jìn)行亞細(xì)胞定位,結(jié)果PtrVCS2基因顯示在細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜中均有表達(dá),表明它可能具有獨(dú)特的轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性。同時(shí)利用原位雜交技術(shù)檢測(cè)其組織表達(dá)模式,結(jié)果顯示PtrVCS2基因主要在形成層中表達(dá),在木質(zhì)部和韌皮部也有部分表達(dá)。本研究對(duì)PtrVCS2基因進(jìn)行毛果楊體內(nèi)功能的研究,構(gòu)建了PtrVCS2過表達(dá)載體及CRISPR載體,進(jìn)行毛果楊的快速遺傳轉(zhuǎn)化。通過對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行不同水平的分子檢測(cè)及測(cè)序的鑒定,獲得了PtrVCS2基因的過表達(dá)植株及突變體植株。對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行表型分析,發(fā)現(xiàn)PtrVCS2過表達(dá)植株明顯矮于野生型毛果楊,且Ptr... 

【文章來源】：東北林業(yè)大學(xué)黑龍江省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：75 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
1 緒論
    1.1 引言
    1.2 樹木木材的形成
        1.2.1 維管形成層的發(fā)育
        1.2.2 維管形成層發(fā)育的轉(zhuǎn)錄調(diào)控
        1.2.3 次生木質(zhì)部分化
        1.2.4 次生木質(zhì)部分化的轉(zhuǎn)錄調(diào)控
    1.3 植物轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)與分類
    1.4 植物ZF-HD基因家族簡(jiǎn)介
        1.4.1 植物ZF-HD轉(zhuǎn)錄因子的起源于進(jìn)化
        1.4.2 ZF-HD轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)與分類
        1.4.3 植物ZF-HD轉(zhuǎn)錄因子家族功能
    1.5 本研究的目的與意義
    1.6 本研究的技術(shù)路線
2 PtrVCS2基因的克隆及表達(dá)分析
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 菌株及載體
        2.1.3 主要試劑
        2.1.4 主要儀器設(shè)備
        2.1.5 藥品及培養(yǎng)基配置
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 RNA-seq數(shù)據(jù)查找PtrVCS2基因及基因克隆
        2.2.2 毛果楊PtrVCS2基因瞬時(shí)表達(dá)載體構(gòu)建及亞細(xì)胞定位
        2.2.3 毛果楊PtrVCS2基因的原位雜交
    2.3 結(jié)果與分析
        2.3.1 RNA-seq數(shù)據(jù)查找PtrVCS2基因及基因克隆
        2.3.2 毛果楊PtrVCS2基因的亞細(xì)胞定位
        2.3.3 毛果楊PtrVCS2基因的原位雜交
    2.4 本章小結(jié)
3 毛果楊PtrVCS2基因過表達(dá)載體構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.1 植物材料
        3.1.2 菌株及載體
        3.1.3 主要試劑
        3.1.4 主要儀器設(shè)備
        3.1.5 藥品及培養(yǎng)基配置
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 毛果楊PtrVCS2基因過表達(dá)載體構(gòu)建
        3.2.2 過表達(dá)PtrVCS2基因的遺傳轉(zhuǎn)化
        3.2.3 轉(zhuǎn)錄水平鑒定轉(zhuǎn)基因植株
    3.3 結(jié)果與分析
        3.3.1 毛果楊PtrVCS2基因過表達(dá)載體構(gòu)建
        3.3.2 過表達(dá)PtrVCS2基因的遺傳轉(zhuǎn)化
        3.3.3 RNA水平鑒定轉(zhuǎn)基因植株
    3.4 本章小結(jié)
4 基于CRISPR/Cas9創(chuàng)制毛果楊-PtrVCS突變體
    4.1 實(shí)驗(yàn)材料
        4.1.1 植物材料
        4.1.2 菌株及載體
        4.1.3 主要試劑
        4.1.4 主要儀器設(shè)備
    4.2 實(shí)驗(yàn)方法
        4.2.1 SgRNA編輯效率的CRISPR/Cas9核糖核蛋白復(fù)合物體外檢測(cè)
        4.2.2 毛果楊-PtrVCS2基因CRISPR載體構(gòu)建
        4.2.3 毛果楊的遺傳轉(zhuǎn)化創(chuàng)制PtrVCS2的突變體
        4.2.4 PtrVCS2突變體的鑒定
    4.3 結(jié)果與分析
        4.3.1 SgRNA編輯效率的CRISPR/Cas9核糖核蛋白復(fù)合物體外檢測(cè)
        4.3.2 毛果楊-PttVCS2基因CRISPR載體構(gòu)建
        4.3.3 毛果楊的遺傳轉(zhuǎn)化創(chuàng)制PtrVCS2的突變體
    4.4 本章小結(jié)
5 毛果楊PtrVCS2基因功能的分析
    5.1 實(shí)驗(yàn)材料
        5.1.1 植物材料
        5.1.2 主要試劑
        5.1.3 主要儀器設(shè)備
    5.2 實(shí)驗(yàn)方法
        5.2.1 PtrVCS2轉(zhuǎn)基因毛果楊生長指標(biāo)的測(cè)定
        5.2.2 PtrVCS2轉(zhuǎn)基因木質(zhì)部掃描電鏡觀察
        5.2.3 轉(zhuǎn)基因毛果楊組織切片化學(xué)染色
    5.3 結(jié)果與分析
        5.3.1 PtrVCS2轉(zhuǎn)基因毛果楊表型及生長狀況的分析
        5.3.2 PtrVCS2轉(zhuǎn)基因毛果楊木質(zhì)部掃描電鏡觀察
        5.3.3 轉(zhuǎn)基因毛果楊組織切片化學(xué)染色
    5.4 本章小結(jié)
6 酵母雙雜篩選毛果楊PtrVCS2互作基因
    6.1 實(shí)驗(yàn)材料
        6.1.1 菌株及載體
        6.1.2 主要試劑
        6.1.3 主要儀器設(shè)備
        6.1.4 藥品及培養(yǎng)基配置
    6.2 實(shí)驗(yàn)方法
        6.2.1 構(gòu)建PtrVCS2基因BD載體
        6.2.2 酵母感受態(tài)的制備
        6.2.3 PtrVCS2基因酵母自激活檢測(cè)
        6.2.4 PtrVCS2基因酵母雙雜篩選互作基因
        6.2.5 雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證PtrVCS2互作基因
    6.3 結(jié)果與分析
        6.3.1 構(gòu)建PtrVCS2基因BD載體
        6.3.2 PtrVCS2基因酵母自激活檢測(cè)
        6.3.3 PtrVCS2基因酵母雙雜交篩選互作基因
        6.3.4 雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證PtrVCS2互作基因
    6.4 本章小結(jié)
討論
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文
致謝



本文編號(hào)：3171361