目的利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構建穩(wěn)定敲除4.1R基因的RAW264.7巨噬細胞株,為研究4.1R在巨噬細胞中的功能奠定基礎。方法根據CRISPR/Cas9靶向原理設計并合成3個特異性識別4.1R基因的向導RNA（sgRNA）,構建sgRNAlenti CRISPRv2重組質粒并轉入293T細胞中制備sgRNA-Cas9慢病毒,慢病毒侵染RAW264.7細胞,嘌呤霉素篩選出陽性細胞并稀釋至單克隆,Western blotting印記檢測單克隆細胞中蛋白4.1R的表達,測序確認單克隆細胞中突變位點。結果 Western blotting印跡檢測結果表明篩選出的1株單克隆細胞中蛋白4.1R的表達完全缺失;測序結果表明該細胞株中4.1R基因發(fā)生了19bp的缺失突變;并且4.1R基因敲除后,RAW264.7細胞的增殖能力顯著增加。結論本研究利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)成功的干擾了巨噬細胞系RAW264.7細胞中4.1R的表達,為研究4.1R在巨噬細胞中的功能提供了有效工具。 

【文章來源】：南方醫(yī)科大學學報. 2017,37(12)北大核心CSCD

【文章頁數】：6 頁

【文章目錄】：
1 材料和方法
    1.1 材料與試劑
    1.2 方法
        1.2.1 sg RNA的設計和寡核苷酸鏈的合成
        1.2.2 重組真核表達質粒lenti CRISPRv2-sgRNA構建
        1.2.3 293T細胞培養(yǎng)與慢病毒制備
        1.2.4 RAW264.7細胞培養(yǎng)與慢病毒侵染
        1.2.5 敲除4.1R基因的RAW264.7細胞株的單克隆篩選
        1.2.6 敲除4.1R基因的RAW264.7細胞株的鑒定
        1.2.7 CCK8細胞增殖實驗
        1.2.8 統(tǒng)計學處理
2 結果
    2.1 sg RNA靶點的選擇及寡核苷酸鏈設計
    2.2 Lenti CRISPRv2-sg RNA載體的構建
    2.3 穩(wěn)定敲除4.1R基因的RAW264.7細胞株的鑒定
    2.4 敲除4.1R基因的RAW264.7細胞增殖能力檢測
3 討論



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