目的利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建穩(wěn)定敲除4.1R基因的RAW264.7巨噬細(xì)胞株,為研究4.1R在巨噬細(xì)胞中的功能奠定基礎(chǔ)。方法根據(jù)CRISPR/Cas9靶向原理設(shè)計(jì)并合成3個(gè)特異性識(shí)別4.1R基因的向?qū)NA（sgRNA）,構(gòu)建sgRNAlenti CRISPRv2重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)入293T細(xì)胞中制備sgRNA-Cas9慢病毒,慢病毒侵染RAW264.7細(xì)胞,嘌呤霉素篩選出陽(yáng)性細(xì)胞并稀釋至單克隆,Western blotting印記檢測(cè)單克隆細(xì)胞中蛋白4.1R的表達(dá),測(cè)序確認(rèn)單克隆細(xì)胞中突變位點(diǎn)。結(jié)果 Western blotting印跡檢測(cè)結(jié)果表明篩選出的1株單克隆細(xì)胞中蛋白4.1R的表達(dá)完全缺失;測(cè)序結(jié)果表明該細(xì)胞株中4.1R基因發(fā)生了19bp的缺失突變;并且4.1R基因敲除后,RAW264.7細(xì)胞的增殖能力顯著增加。結(jié)論本研究利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)成功的干擾了巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞中4.1R的表達(dá),為研究4.1R在巨噬細(xì)胞中的功能提供了有效工具。 

【文章來(lái)源】：南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào). 2017,37(12)北大核心CSCD

【文章頁(yè)數(shù)】：6 頁(yè)

【文章目錄】：
1 材料和方法
    1.1 材料與試劑
    1.2 方法
        1.2.1 sg RNA的設(shè)計(jì)和寡核苷酸鏈的合成
        1.2.2 重組真核表達(dá)質(zhì)粒lenti CRISPRv2-sgRNA構(gòu)建
        1.2.3 293T細(xì)胞培養(yǎng)與慢病毒制備
        1.2.4 RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)與慢病毒侵染
        1.2.5 敲除4.1R基因的RAW264.7細(xì)胞株的單克隆篩選
        1.2.6 敲除4.1R基因的RAW264.7細(xì)胞株的鑒定
        1.2.7 CCK8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)
        1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
2 結(jié)果
    2.1 sg RNA靶點(diǎn)的選擇及寡核苷酸鏈設(shè)計(jì)
    2.2 Lenti CRISPRv2-sg RNA載體的構(gòu)建
    2.3 穩(wěn)定敲除4.1R基因的RAW264.7細(xì)胞株的鑒定
    2.4 敲除4.1R基因的RAW264.7細(xì)胞增殖能力檢測(cè)
3 討論



本文編號(hào)：3165682