棉花是世界重要經(jīng)濟(jì)作物之一,棉籽油的生產(chǎn)和棉纖維的供給對(duì)于工商業(yè)都具有非凡的意義。在我國(guó),棉花同樣是重要的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)作物,然而,基于我國(guó)耕地面積緊張、人口基數(shù)大的國(guó)情,棉花的種植面積極為受限,糧棉爭(zhēng)地矛盾突出。開(kāi)花意味著植物開(kāi)始以生殖生長(zhǎng)為生長(zhǎng)中心,早花可以促進(jìn)早熟,實(shí)現(xiàn)植物生育期的縮短。因此,從棉花花期調(diào)控角度入手,攻克棉花開(kāi)花調(diào)控關(guān)鍵機(jī)制,實(shí)現(xiàn)棉花優(yōu)質(zhì)短季棉的培育是緩解當(dāng)前土地局勢(shì),優(yōu)化農(nóng)業(yè)種植結(jié)構(gòu),實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)高效的重要方法之一。前人研究表明,花期調(diào)控已逐步研究解析多種調(diào)控路徑,每個(gè)路徑都有其關(guān)鍵基因所在,例如FLC基因在春化途徑中具有重要作用,對(duì)成花起著負(fù)調(diào)控的作用;CO基因在光周期途徑中具有重要意義,是外界光周期變化與植物自身開(kāi)花調(diào)控的維系等。本實(shí)驗(yàn)從棉花花芽啟動(dòng)的關(guān)鍵時(shí)期入手,通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、超表達(dá)技術(shù)、CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)、matting法酵母文庫(kù)篩選實(shí)驗(yàn)技術(shù)和亞細(xì)胞定位技術(shù)等手段,進(jìn)行從面到點(diǎn)的分析研究,主要研究成果如下:（1）通過(guò)將花芽形成過(guò)程進(jìn)行時(shí)期切割,細(xì)分為花芽未分化、即將分化、開(kāi)始分化和分化完成四個(gè)時(shí)期,以轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的技術(shù)手段,關(guān)注花芽形成過(guò)程中轉(zhuǎn)錄組... 

【文章來(lái)源】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)山東省

【文章頁(yè)數(shù)】：78 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
符號(hào)說(shuō)明
中文摘要
Abstract
1 前言
    1.1 花的形成
        1.1.1 成花誘導(dǎo)與成花啟動(dòng)
        1.1.2 花器官發(fā)育
    1.2 開(kāi)花控制途徑
        1.2.1 光周期途徑
        1.2.2 春化作用途徑
        1.2.3 赤霉素誘導(dǎo)途徑
        1.2.4 溫敏途徑
        1.2.5 年齡途徑
        1.2.6 自主途徑
    1.3 調(diào)控植物開(kāi)花時(shí)間的相關(guān)研究現(xiàn)狀
    1.4 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)
    1.5 酵母雙雜交系統(tǒng)
        1.5.1 酵母雙雜交系統(tǒng)
        1.5.2 核體系酵母文庫(kù)與膜體系酵母文庫(kù)
    1.6 亞細(xì)胞定位
    1.7 CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)
        1.7.1 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)和原理
        1.7.2 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的功能和應(yīng)用
    1.8 本研究目的與意義
2 材料與方法
    2.1 實(shí)驗(yàn)時(shí)間、地點(diǎn)與實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 實(shí)驗(yàn)時(shí)間和地點(diǎn)
        2.1.2 實(shí)驗(yàn)材料
    2.2 棉花不同花芽分化時(shí)期的莖尖材料取樣
    2.3 棉花不同花芽分化時(shí)期轉(zhuǎn)錄組測(cè)序
        2.3.1 總RNA的分別提取
        2.3.2 RNA-seq文庫(kù)構(gòu)建與測(cè)序
        2.3.3 序列比對(duì)與分析
        2.3.4 基因表達(dá)量統(tǒng)計(jì)與功能注釋
    2.4 超表達(dá)載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)化
        2.4.1 目的基因克隆
        2.4.2 DH5α大腸桿菌感受態(tài)制備
        2.4.3 TOPO載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)化大腸桿菌
        2.4.4 質(zhì)粒小提
        2.4.5 以LR反應(yīng)進(jìn)行超表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化大腸桿菌
        2.4.6 農(nóng)桿菌感受態(tài)制備
        2.4.7 超表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌
        2.4.8 花粉管通道法轉(zhuǎn)化棉花并收取種子
        2.4.9 蘸花法轉(zhuǎn)化擬南芥并收取種子
    2.5 CRISPR/Cas9 基因編輯載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)化
        2.5.1 sgRNA的設(shè)計(jì)
        2.5.2 CRISPR/Cas9 表達(dá)載體的引物設(shè)計(jì)
        2.5.3 CRISPR/Cas9 插入片段的制備
        2.5.4 載體線性化
        2.5.5 一步克隆法連接插入片段與線性化載體
        2.5.6 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化
    2.6 matting法雙雜交文庫(kù)篩選
        2.6.1 酵母感受態(tài)制備
        2.6.2 BD載體構(gòu)建
        2.6.3 誘餌基因自激活和毒性檢測(cè)
        2.6.4 matting法雙雜交文庫(kù)篩選
    2.7 亞細(xì)胞定位
3 結(jié)果與分析
    3.1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)及分析
        3.1.1 轉(zhuǎn)錄組下機(jī)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)
        3.1.2 測(cè)序質(zhì)量評(píng)估
        3.1.3 基于表達(dá)量的測(cè)序評(píng)估
        3.1.4 樣品相關(guān)性分析
        3.1.5 基因表達(dá)差異分析
        3.1.6 差異表達(dá)基因的GO富集分析
        3.1.7 差異表達(dá)基因的KEGG Pathway富集分析
        3.1.8 可變剪切及新轉(zhuǎn)錄本分析
        3.1.9 基于表達(dá)量的差異基因分析與候選基因選定
    3.2 候選基因的表達(dá)模式驗(yàn)證和分析
        3.2.1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)驗(yàn)證
        3.2.2 不同組織和處理?xiàng)l件下候選基因的表達(dá)模式分析
    3.3 候選基因的超表達(dá)實(shí)驗(yàn)
        3.3.1 候選基因的克隆
        3.3.2 表達(dá)載體的構(gòu)建和檢驗(yàn)
        3.3.3 表達(dá)載體的遺傳轉(zhuǎn)化
    3.4 候選基因的CRISPR/Cas9 基因編輯實(shí)驗(yàn)
        3.4.1 靶標(biāo)選擇和引物設(shè)計(jì)
        3.4.2 表達(dá)載體的構(gòu)建
        3.4.3 表達(dá)載體的驗(yàn)證和轉(zhuǎn)化
        3.4.4 表達(dá)載體的遺傳轉(zhuǎn)化
    3.5 候選基因的matting法雙雜交文庫(kù)篩選
        3.5.1 候選蛋白的跨膜區(qū)分析
        3.5.2 誘餌基因自激活檢測(cè)和毒性檢測(cè)
        3.5.3 互作蛋白的篩選
    3.6 候選基因結(jié)構(gòu)分析和亞細(xì)胞定位驗(yàn)證
        3.6.1 候選蛋白的Pfam分析
        3.6.2 候選蛋白的信號(hào)肽分析
        3.6.3 候選蛋白的亞細(xì)胞定位
        3.6.4 候選蛋白的蛋白修飾分析
4 討論
    4.1 基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)的差異基因表達(dá)特征分析
    4.2 基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)的可變剪切分析
    4.3 候選基因的作用機(jī)理預(yù)測(cè)分析和蛋白互作實(shí)驗(yàn)選擇
    4.4 棉花花期調(diào)控研究的重要性
5 結(jié)論
6 參考文獻(xiàn)
7 致謝
8 攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文情況


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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[3]全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序在植物中的應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 趙陸滟,曹紹玉,龍?jiān)茦?shù),張應(yīng)華,許俊強(qiáng).  植物遺傳資源學(xué)報(bào). 2019(06)
[4]系統(tǒng)發(fā)育基因組學(xué)方法研究進(jìn)展[J]. 李佳璇,梁丹,張鵬.  中國(guó)科學(xué):生命科學(xué). 2019(04)
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[6]第三代測(cè)序技術(shù)在轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究中的應(yīng)用[J]. 李玉梅,李書(shū)嫻,李向上,李川昀.  生命科學(xué)儀器. 2018(Z1)
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[10]酵母雙雜交系統(tǒng)及其應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 崔紅軍,魏玉清.  安徽農(nóng)業(yè)科學(xué). 2015(13)

博士論文
[1]Split-ubiquitin膜蛋白酵母雙雜交系統(tǒng)的構(gòu)建及其應(yīng)用[D]. 曹煒.復(fù)旦大學(xué) 2007

碩士論文
[1]玉米ZmHAK1與ZmCIPK23蛋白相互作用研究[D]. 趙可菡.吉林大學(xué) 2019
[2]堿蓬脫水素蛋白（SsDHN）的亞細(xì)胞定位及功能研究[D]. 馬寶月.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué) 2019
[3]水稻miRNAs靶基因驗(yàn)證瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建及應(yīng)用[D]. 曹雅倩.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 2018
[4]水稻膜系統(tǒng)酵母雙雜交cDNA文庫(kù)及OsVDAC5誘餌蛋白載體的構(gòu)建與鑒定[D]. 陳利維.中南民族大學(xué) 2014
[5]以腸道病毒71型3C蛋白酶為靶點(diǎn)的藥物篩選模型的建立及藥物篩選[D]. 秦咸蘊(yùn).曲阜師范大學(xué) 2011



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