目的:基因編輯技術(shù)的不斷發(fā)展為基因功能和基因治療等研究提供了強(qiáng)大的技術(shù)支持。CRISPR/Cas9作為新興的基因編輯技術(shù),具有更高效的編輯能力。2013年張鋒課題組首次使用CRISPR/Cas9技術(shù)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行基因改造,利用sgRNA文庫(kù)實(shí)現(xiàn)對(duì)多個(gè)基因的敲除,極大的提高了基因編輯效率,同時(shí)降低了脫靶效應(yīng)。目前大規(guī)模CRISPR/Cas9文庫(kù)篩選被應(yīng)用到多個(gè)領(lǐng)域,可進(jìn)行篩選藥靶基因、耐藥基因及腫瘤增殖基因等。本研究一方面通過(guò)在HCT 116細(xì)胞內(nèi)大規(guī)模感染GeCKO慢病毒文庫(kù),在全基因組范圍篩選與HCT 116細(xì)胞增殖相關(guān)的基因。另一方面,通過(guò)在HCT 116細(xì)胞內(nèi)大規(guī)模感染GeCKO慢病毒文庫(kù)后,對(duì)細(xì)胞進(jìn)行輻射損傷處理,以篩選出與細(xì)胞抗輻射相關(guān)的基因。方法:HCT 116細(xì)胞增殖相關(guān)基因篩選:1)將HCT 116細(xì)胞培養(yǎng)至約3 10⁸個(gè),使用GeCKO慢病毒文庫(kù)進(jìn)行大規(guī)模感染;感染1天后,更換為含有2 g/l嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)6天,收取部分細(xì)胞作為6天樣品組,剩余細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)至16天,并收取細(xì)胞。2)提取各組樣品基因組DNA,采用巢式PCR法擴(kuò)增... 

【文章來(lái)源】：安徽醫(yī)科大學(xué)安徽省

【文章頁(yè)數(shù)】：79 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
中文摘要
abstract
第一章 利用CRISPR/Cas9 全基因組文庫(kù)篩選HCT116 細(xì)胞增殖相關(guān)基因
    1 前言
    2 材料與方法
        2.1 實(shí)驗(yàn)材料
            2.1.1 細(xì)胞系
            2.1.2 主要試劑與材料
            2.1.3 主要儀器
            2.1.4 主要溶液的配制
        2.2 實(shí)驗(yàn)方法
            2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)
            2.2.2 GeCKO文庫(kù)大規(guī)模感染細(xì)胞
            2.2.3 細(xì)胞基因組DNA提取
            2.2.4 巢式PCR擴(kuò)增sgRNA序列
            2.2.5 瓊脂糖凝膠電泳
            2.2.6 瓊脂糖凝膠DNA回收
            2.2.7 T載體連接
            2.2.8 Illumina測(cè)序平臺(tái)高通量測(cè)序與生物信息學(xué)分析
            2.2.9 miRNA靶基因預(yù)測(cè)
    3 結(jié)果
        3.1 基因組插入sg RNA序列驗(yàn)證
        3.2 基因組插入sg RNA大規(guī)模測(cè)序及分析
        3.3 增殖相關(guān)陰性篩選基因GO富集分析
        3.4 增殖相關(guān)陽(yáng)性篩選基因GO富集分析
        3.5 增殖相關(guān)mi RNA靶基因網(wǎng)絡(luò)分析
    4 討論
    5 小結(jié)
第二章 利用CRISPR/Cas9 全基因組文庫(kù)篩選HCT116 細(xì)胞輻射相關(guān)基因
    1 前言
    2.材料與方法
        2.1 實(shí)驗(yàn)材料
            2.1.1 細(xì)胞系
            2.1.2 主要試劑與材料
            2.1.3 主要儀器
        2.2 實(shí)驗(yàn)方法
            2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)
            2.2.2 GeCKO文庫(kù)大規(guī)模感染細(xì)胞
            2.2.3 細(xì)胞輻射處理
            2.2.4 細(xì)胞基因組DNA提取
            2.2.5 Illumina測(cè)序平臺(tái)高通量測(cè)序
            2.2.6 生物信息學(xué)分析
            2.2.7 細(xì)胞內(nèi)干涉RPL12、MESP1 基因
            2.2.8 qPCR檢測(cè)基因表達(dá)水平
            2.2.9 CCK8 法檢測(cè)細(xì)胞增殖
    3 結(jié)果
        3.1 測(cè)序數(shù)據(jù)產(chǎn)出與質(zhì)量統(tǒng)計(jì)
        3.2 數(shù)據(jù)比對(duì)與Screen Read count分析
        3.3 gRNA和基因計(jì)數(shù)
        3.4 丟失gRNA與丟失基因數(shù)目統(tǒng)計(jì)
        3.5 樣本聚類分析
        3.6 MAGeCK軟件beta score算法篩選與輻射相關(guān)的基因
        3.7 輻射相關(guān)陰性篩選基因GO富集分析
        3.8 輻射相關(guān)陽(yáng)性篩選基因GO富集分析
        3.9 輻射相關(guān)mi RNA靶基因網(wǎng)絡(luò)分析
        3.10 輻射相關(guān)基因RPL12、MESP1 的初步功能驗(yàn)證
    4 討論
    5 小結(jié)
總結(jié)
參考文獻(xiàn)
附錄1
附錄2
致謝
綜述
    參考文獻(xiàn)



本文編號(hào)：3162654