目的:基因編輯技術(shù)的不斷發(fā)展為基因功能和基因治療等研究提供了強大的技術(shù)支持。CRISPR/Cas9作為新興的基因編輯技術(shù),具有更高效的編輯能力。2013年張鋒課題組首次使用CRISPR/Cas9技術(shù)在哺乳動物細胞中進行基因改造,利用sgRNA文庫實現(xiàn)對多個基因的敲除,極大的提高了基因編輯效率,同時降低了脫靶效應。目前大規(guī)模CRISPR/Cas9文庫篩選被應用到多個領域,可進行篩選藥靶基因、耐藥基因及腫瘤增殖基因等。本研究一方面通過在HCT 116細胞內(nèi)大規(guī)模感染GeCKO慢病毒文庫,在全基因組范圍篩選與HCT 116細胞增殖相關的基因。另一方面,通過在HCT 116細胞內(nèi)大規(guī)模感染GeCKO慢病毒文庫后,對細胞進行輻射損傷處理,以篩選出與細胞抗輻射相關的基因。方法:HCT 116細胞增殖相關基因篩選:1)將HCT 116細胞培養(yǎng)至約3 10⁸個,使用GeCKO慢病毒文庫進行大規(guī)模感染;感染1天后,更換為含有2 g/l嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)6天,收取部分細胞作為6天樣品組,剩余細胞繼續(xù)培養(yǎng)至16天,并收取細胞。2)提取各組樣品基因組DNA,采用巢式PCR法擴增... 

【文章來源】：安徽醫(yī)科大學安徽省

【文章頁數(shù)】：79 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
中文摘要
abstract
第一章 利用CRISPR/Cas9 全基因組文庫篩選HCT116 細胞增殖相關基因
    1 前言
    2 材料與方法
        2.1 實驗材料
            2.1.1 細胞系
            2.1.2 主要試劑與材料
            2.1.3 主要儀器
            2.1.4 主要溶液的配制
        2.2 實驗方法
            2.2.1 細胞培養(yǎng)
            2.2.2 GeCKO文庫大規(guī)模感染細胞
            2.2.3 細胞基因組DNA提取
            2.2.4 巢式PCR擴增sgRNA序列
            2.2.5 瓊脂糖凝膠電泳
            2.2.6 瓊脂糖凝膠DNA回收
            2.2.7 T載體連接
            2.2.8 Illumina測序平臺高通量測序與生物信息學分析
            2.2.9 miRNA靶基因預測
    3 結(jié)果
        3.1 基因組插入sg RNA序列驗證
        3.2 基因組插入sg RNA大規(guī)模測序及分析
        3.3 增殖相關陰性篩選基因GO富集分析
        3.4 增殖相關陽性篩選基因GO富集分析
        3.5 增殖相關mi RNA靶基因網(wǎng)絡分析
    4 討論
    5 小結(jié)
第二章 利用CRISPR/Cas9 全基因組文庫篩選HCT116 細胞輻射相關基因
    1 前言
    2.材料與方法
        2.1 實驗材料
            2.1.1 細胞系
            2.1.2 主要試劑與材料
            2.1.3 主要儀器
        2.2 實驗方法
            2.2.1 細胞培養(yǎng)
            2.2.2 GeCKO文庫大規(guī)模感染細胞
            2.2.3 細胞輻射處理
            2.2.4 細胞基因組DNA提取
            2.2.5 Illumina測序平臺高通量測序
            2.2.6 生物信息學分析
            2.2.7 細胞內(nèi)干涉RPL12、MESP1 基因
            2.2.8 qPCR檢測基因表達水平
            2.2.9 CCK8 法檢測細胞增殖
    3 結(jié)果
        3.1 測序數(shù)據(jù)產(chǎn)出與質(zhì)量統(tǒng)計
        3.2 數(shù)據(jù)比對與Screen Read count分析
        3.3 gRNA和基因計數(shù)
        3.4 丟失gRNA與丟失基因數(shù)目統(tǒng)計
        3.5 樣本聚類分析
        3.6 MAGeCK軟件beta score算法篩選與輻射相關的基因
        3.7 輻射相關陰性篩選基因GO富集分析
        3.8 輻射相關陽性篩選基因GO富集分析
        3.9 輻射相關mi RNA靶基因網(wǎng)絡分析
        3.10 輻射相關基因RPL12、MESP1 的初步功能驗證
    4 討論
    5 小結(jié)
總結(jié)
參考文獻
附錄1
附錄2
致謝
綜述
    參考文獻



本文編號：3162654