文心蘭（Oncidium hybridum）是蘭科（Orchidaceae）文心蘭屬植物,具有發(fā)展前景的熱帶花卉。Fd（ferredoxin）和FNR（ferredoxin-NADP⁺oxidoreductase）作為高等植物中廣泛存在的電子傳遞蛋白,廣泛參與植物細(xì)胞的生理生化過程。植物中存在多種類型的Fd和FNR,不僅提供氧化還原的能量,而且在逆境脅迫下發(fā)揮作用。本研究對(duì)文心蘭中Fd及FNR基因進(jìn)行克隆及分析,并利用過表達(dá)及CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)FdC2及RFNR基因在文心蘭類原球莖（protocorm-like body,PLB）的發(fā)育進(jìn)行研究。主要結(jié)果如下:1.文心蘭Fd基因的克隆及表達(dá)分析以文心蘭類原球莖及試管苗的混合樣品為材料,根據(jù)文心蘭轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選獲得7條Fd基因的序列,克隆獲得文心蘭中Fd基因家族的成員,它們編碼的氨基酸數(shù)目均少于200個(gè)�；旧镄畔W(xué)分析表明:文心蘭Fd基因家族包括1個(gè)線粒體型的MFDX和6個(gè)葉綠體型的Fd,它們與蝴蝶蘭中的Fd親緣關(guān)系較近;文心蘭Fd基因家族在進(jìn)化過程中,受突變壓力、自然選擇及其它因素的影響形成了使用A/... 

【文章來源】：福建農(nóng)林大學(xué)福建省

【文章頁數(shù)】：107 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
縮寫詞
摘要
Abstract
第一章 引言
    1.1 文心蘭組織培養(yǎng)研究進(jìn)展
    1.2 植物鐵氧還蛋白和鐵氧還蛋白氧化還原酶研究進(jìn)展
    1.3 植物中CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)研究進(jìn)展
    1.4 文心蘭遺傳轉(zhuǎn)化研究進(jìn)展
    1.5 本研究的意義和主要研究?jī)?nèi)容
第二章 文心蘭Fd基因的克隆及分析
    第一節(jié) 文心蘭Fd基因的克隆及生物信息學(xué)分析
        1 材料與方法
            1.1 材料
            1.2 方法
        2 結(jié)果與分析
            2.1 文心蘭Fd基因的克隆
            2.2 文心蘭Fd基因家族成員的生物信息學(xué)分析
        3 討論
            3.1 文心蘭Fd基因的類型
            3.2 文心蘭Fd基因的分子特性
    第二節(jié) 文心蘭Fd基因密碼子偏好性分析
        1 材料與方法
            1.1 材料
            1.2 方法
        2 結(jié)果與分析
            2.1 文心蘭Fd基因有效密碼子數(shù)和GC含量
            2.2 文心蘭Fd基因同義密碼子相對(duì)使用度
            2.3 基于密碼子使用偏好性和氨基酸序列的系統(tǒng)聚類
            2.4 中性繪圖分析
            2.5 ENC繪圖分析
            2.6 PR2 偏差分析
        3 討論
            3.1 文心蘭Fd基因密碼子偏好性分析
            3.2 文心蘭Fd基因密碼子偏好性影響因素
    第三節(jié) 文心蘭Fd基因表達(dá)分析
        1 材料與方法
            1.1 材料
            1.2 方法
        2 結(jié)果與分析
            2.1 文心蘭Fd基因不同組織部位及不同發(fā)育階段的表達(dá)分析
            2.2 軟腐病不同感病時(shí)間文心蘭Fd基因表達(dá)分析
            2.3 高溫處理不同時(shí)間文心蘭Fd基因表達(dá)分析
        3 討論
            3.1 文心蘭Fd基因具有組織表達(dá)特異性
            3.2 Fd基因均參與文心蘭的生長(zhǎng)發(fā)育及脅迫響應(yīng)
第三章 文心蘭FNR基因的克隆及分析
    第一節(jié) 文心蘭RFNR基因的克隆及FNR基因生物信息學(xué)分析
        1 材料與方法
            1.1 試驗(yàn)材料
            1.2 方法
        2 結(jié)果與分析
            2.1 文心蘭RFNR基因的克隆
            2.2 文心蘭FNR基因生物信息學(xué)分析
        3 討論
            3.1 文心蘭RFNR比 LFNR保守性更強(qiáng)
    第二節(jié) 蘭科植物FNR基因的密碼子偏好性分析
        1 材料與方法
            1.1 材料
            1.2 方法
        2 結(jié)果與分析
            2.1 蘭科植物FNR基因有效密碼子數(shù)和GC含量
            2.2 蘭科植物FNR基因同義密碼子相對(duì)使用度
            2.3 主要偏好密碼子分析
            2.4 不同區(qū)域FNR基因密碼子偏好性分析
            2.5 基于密碼子使用偏好性和CDS序列的系統(tǒng)聚類
            2.6 中性繪圖分析
            2.7 ENC繪圖分析
            2.8 PR2 偏差分析
        3 討論
            3.1 蘭科植物FNR基因密碼子偏好性分析
            3.2 蘭科植物FNR基因聚類分析比較
            3.3 蘭科植物FNR基因密碼子偏好性影響因素
    第三節(jié) 文心蘭FNR基因表達(dá)分析
        1 材料與方法
            1.1 試驗(yàn)材料及處理方法
            1.2 方法
        2 結(jié)果與分析
            2.1 FNR基因在文心蘭不同組織部位及不同發(fā)育階段的表達(dá)分析
            2.2 FNR基因在文心蘭不同脅迫處理下的表達(dá)分析
        3 討論
            3.1 文心蘭FNR基因具有組織表達(dá)特異性
            3.2 文心蘭LFNR基因和RFNR基因在生長(zhǎng)發(fā)育及脅迫響應(yīng)中都具有差異性
第四章 文心蘭FdC2和RFNR的亞細(xì)胞定位及過表達(dá)研究
    第一節(jié) 文心蘭FdC2和RFNR的亞細(xì)胞定位觀察
        1 材料與方法
            1.1 試驗(yàn)材料
            1.2 試驗(yàn)試劑及儀器
            1.3 FdC2及RFNR的 pCAMBIA1302 載體的構(gòu)建
            1.4 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)
            1.5 農(nóng)桿菌侵染煙草及文心蘭葉片
            1.6 亞細(xì)胞定位觀察
        2 結(jié)果與分析
            2.1 酶切位點(diǎn)分析結(jié)果
            2.2 目的片段及線性化載體的獲得
            2.3 重組載體的建立
            2.4 煙草葉片亞細(xì)胞定位結(jié)果
            2.5 文心蘭葉片亞細(xì)胞定位結(jié)果
        3 討論
            3.1 文心蘭FdC2 蛋白均定位于葉綠體
            3.2 文心蘭LFNR和 RFNR蛋白定位于葉綠體
    第二節(jié) 過表達(dá)FdC2和RFNR的類原球莖分子檢測(cè)及形態(tài)觀察
        1 材料與方法
            1.1 受體材料
            1.2 方法
        2 結(jié)果與分析
            2.1 過表達(dá)FdC2及RFNR的文心蘭類原球莖中標(biāo)記基因的檢測(cè)
            2.2 過表達(dá)FdC2及RFNR的文心蘭類原球莖中FdC2及FNR基因的表達(dá)分析
            2.3 軟腐病菌處理過表達(dá)FdC2及RFNR基因的文心蘭類原球莖中Fd C2及RFNR基因的表達(dá)分析
            2.4 篩選30 d文心蘭類原球莖GFP熒光觀察
            2.5 過表達(dá)FdC2和RFNR的文心蘭的表型觀察
        3 討論
            3.1 FdC2及RFNR在文心蘭抵抗軟腐病脅迫中發(fā)揮重要作用
            3.2 FdC2和RFNR均參與文心蘭類原球莖的生長(zhǎng)發(fā)育
第五章 CRISPR/Cas9 介導(dǎo)的文心蘭FdC2和RFNR的功能研究
    第一節(jié) FdC2和RFNR的 CRISPR/Cas9 載體構(gòu)建及原生質(zhì)體制備
        1 材料與方法
            1.1 試驗(yàn)材料
            1.2 試驗(yàn)方法
        2 結(jié)果與分析
            2.1 文心蘭FdC2及RFNR的 gDNA序列的獲得
            2.2 sg RNA表達(dá)盒的擴(kuò)增以及重組質(zhì)粒的鑒定
            2.3 原生質(zhì)體的制備
        3 討論
            3.1 文心蘭FdC2及RFNR的比較
            3.2 原生質(zhì)體可作為文心蘭遺傳轉(zhuǎn)化受體
    第二節(jié) 文心蘭FdC2和RFNR基因編輯后的分子檢測(cè)及形態(tài)觀察
        1 材料與方法
            1.1 檢測(cè)材料
            1.2 試驗(yàn)方法
        2 結(jié)果與分析
            2.1 CRISPR/Cas9 介導(dǎo)的FdC2和RFNR轉(zhuǎn)化及Cas9 的PCR檢測(cè)
            2.2 轉(zhuǎn)化后文心蘭FdC2和RFNR的高分辨率溶解曲線（HRM）檢測(cè)結(jié)果
            2.3 轉(zhuǎn)基因文心蘭FdC2和RFNR基因編輯效果的檢測(cè)
            2.4 轉(zhuǎn)基因文心蘭FdC2和RFNR基因被編輯后序列的分析
            2.5 FdC2和RFNR基因編輯后文心蘭類原球莖的形態(tài)觀察
        3 討論
            3.1 FdC2 參與文心蘭類原球莖的分化
            3.2 RFNR基因參與文心蘭類原球莖的發(fā)育過程
第六章 Fd3和LFNR轉(zhuǎn)基因文心蘭類原球莖的形態(tài)觀察
    1 材料方法
    2 結(jié)果分析
        2.1 基因表達(dá)分析
        2.2 形態(tài)發(fā)育觀察
    3 討論
        3.1 Fd3和LFNR參與文心蘭類原球莖的發(fā)育過程
        3.2 Fd3和LFNR顯著影響文心蘭類原球莖發(fā)育的分子細(xì)胞學(xué)機(jī)制
第七章 結(jié)論與展望
    1 結(jié)論
    2 展望
參考文獻(xiàn)
在碩士學(xué)習(xí)期間發(fā)表學(xué)術(shù)論文情況
在碩士學(xué)習(xí)期間參加學(xué)術(shù)會(huì)議情況
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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[2]植物基因組編輯檢測(cè)方法[J]. 劉春霞,耿立召,許建平.  遺傳. 2018(12)
[3]CRISPR/Cas9介導(dǎo)的植物基因編輯技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 時(shí)歡,林玉玲,賴鐘雄,杜宜殷,黃鵬林.  應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào). 2018(03)
[4]橄欖查爾酮異構(gòu)酶基因CHI的密碼子偏好模式[J]. 賴瑞聯(lián),馮新,陳瑾,韋曉霞,陳義挺,吳如健.  應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào). 2017(05)
[5]南茜文心蘭軟腐病病原分離鑒定及致病性分析[J]. 楊學(xué),葉煒,李永清,江金蘭,曹奕鴦,雷伏貴.  亞熱帶植物科學(xué). 2017(03)
[6]CRISPR-Cas系統(tǒng)在植物基因組編輯中的研究進(jìn)展[J]. 王春,王克劍.  生物工程學(xué)報(bào). 2017(10)
[7]基因編輯技術(shù)及其在園藝作物中的應(yīng)用和展望[J]. 崔霞,張率斌.  園藝學(xué)報(bào). 2017(09)
[8]植物CPR基因密碼子偏好性及聚類分析[J]. 程麗,李宜奎,李曉丹,錢彬彬,徐晟,夏冰,汪仁.  分子植物育種. 2017(05)
[9]霍山石斛轉(zhuǎn)錄因子MYB1R1密碼子選用偏好性分析[J]. 謝析穎,李蓉,林玉玲,郭容芳,陳裕坤,賴鐘雄,徐涵.  分子植物育種. 2017(05)
[10]香蕉CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)體系的建立[J]. 胡春華,鄧貴明,孫曉玄,左存武,李春雨,鄺瑞彬,楊喬松,易干軍.  中國農(nóng)業(yè)科學(xué). 2017(07)

博士論文
[1]CRISPR/Cas9系統(tǒng)在植物基因組編輯中的應(yīng)用[D]. 邢慧麗.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 2017
[2]CRISPR-Cas9介導(dǎo)的玉米基因組定點(diǎn)編輯研究[D]. 朱金潔.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 2015
[3]CRISPR/Cas9基因定點(diǎn)突變體系構(gòu)建與大豆抗旱相關(guān)gma-miR160功能研究[D]. 孫現(xiàn)軍.西北農(nóng)林科技大學(xué) 2015
[4]龍眼胚性培養(yǎng)物抗性相關(guān)基因的克隆與功能鑒定[D]. 葉煒.福建農(nóng)林大學(xué) 2015
[5]稻瘟菌誘導(dǎo)性水稻OsFd和OsFNR基因的cDNA克隆與誘導(dǎo)表達(dá)[D]. 耿麗華.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 2004

碩士論文
[1]文心蘭離體培養(yǎng)優(yōu)化及轉(zhuǎn)化鐵氧還蛋白基因研究[D]. 吳曉佩.福建農(nóng)林大學(xué) 2017
[2]霍山石斛生物鐘相關(guān)基因克隆及其與培養(yǎng)物糖含量分析[D]. 謝析穎.福建農(nóng)林大學(xué) 2017
[3]文心蘭OnACO2與OnERS1基因的克隆及表達(dá)分析[D]. 田曉巖.海南大學(xué) 2015
[4]擬南芥CBF3基因轉(zhuǎn)化文心蘭的研究[D]. 甘露.海南大學(xué) 2010
[5]根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)ACS反義基因轉(zhuǎn)化文心蘭的研究[D]. 金蘋.福建農(nóng)林大學(xué) 2009



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