木質(zhì)纖維素是規(guī)模最大、分布范圍最廣、含量最豐富的一類可再生資源。微生物產(chǎn)生的纖維素酶降解纖維素產(chǎn)生的葡萄糖,可進(jìn)一步被轉(zhuǎn)化為乙醇等其它能源物質(zhì)可以緩解目前的能源壓力。嗜熱毀絲霉能夠產(chǎn)生熱穩(wěn)定性的纖維素酶,被稱為潛在的高效中高溫酶庫(kù)。環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate,cAMP）是細(xì)胞內(nèi)參與調(diào)節(jié)物質(zhì)代謝和生物學(xué)功能的重要物質(zhì),是生物體內(nèi)重要的第二信使。它能夠降低真菌的碳代謝阻遏效應(yīng)從而提高真菌產(chǎn)纖維素酶的能力,而腺苷酸環(huán)化酶和磷酸二酯酶可共同調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的cAMP水平。本研究主要利用RNAi技術(shù)干擾嗜熱毀絲霉的腺苷酸環(huán)化酶和磷酸二酯酶基因的表達(dá),及使用外源添加cAMP的方法,從多角度來(lái)研究cAMP及相關(guān)基因在嗜熱毀絲霉基因表達(dá)調(diào)控中的作用。本論文的主要內(nèi)容如下:1)干擾腺苷酸環(huán)化酶基因方面:腺苷酸環(huán)化酶是細(xì)胞響應(yīng)外界環(huán)境信號(hào)、調(diào)節(jié)胞內(nèi)cAMP水平的關(guān)鍵酶,同時(shí)也是能夠催化ATP形成cAMP的唯一酶。本研究針對(duì)嗜熱毀絲霉腺苷酸環(huán)化酶ac基因設(shè)計(jì)干擾序列,利用pUC19-MtPpdc-MtTpdc質(zhì)粒構(gòu)建重組干擾表達(dá)載體。將干擾表達(dá)載體和pAN7-1質(zhì)粒共... 

【文章來(lái)源】：深圳大學(xué)廣東省

【文章頁(yè)數(shù)】：72 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第1章 緒論
    1.纖維素酶概述
    2.嗜熱毀絲霉概述
    3.cAMP在真菌產(chǎn)酶中的研究概況
        3.1 cAMP概述
        3.2 cAMP在真菌產(chǎn)酶中的研究進(jìn)展
    4.碳代謝阻遏效應(yīng)
    5.RNA干擾技術(shù)在真菌中的應(yīng)用
    6.iTRAQ技術(shù)
    7.本文的主要研究?jī)?nèi)容和意義
第2章 RNA干擾嗜熱毀絲霉腺苷酸環(huán)化酶基因?qū)w維素酶活性的影響
    1.實(shí)驗(yàn)材料和方法
        1.1 實(shí)驗(yàn)材料
            1.1.1 菌株與質(zhì)粒
            1.1.2 培養(yǎng)基與試劑
            1.1.3 相關(guān)儀器和設(shè)備
            1.1.4 寡核苷酸引物
        1.2 實(shí)驗(yàn)方法
            1.2.1 腺苷酸環(huán)化酶基因ac的 siRNA寡核苷酸片段的設(shè)計(jì)及合成
            1.2.2 siRNA寡核苷酸片段退火
            1.2.3 質(zhì)粒提取及酶切
            1.2.4 腺苷酸環(huán)化酶基因干擾表達(dá)載體構(gòu)建
            1.2.5 嗜熱毀絲霉原生質(zhì)體制備與轉(zhuǎn)化
            1.2.6 轉(zhuǎn)化子基因組DNA提取及驗(yàn)證
            1.2.7 嗜熱毀絲霉總RNA提取
            1.2.8 RT-qPCR
        1.3 纖維素酶活性的測(cè)定
            1.3.1 FPA酶活的測(cè)定
            1.3.2 CMC酶活的測(cè)定
            1.3.3 BG酶活的測(cè)定
    2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
        2.1 ac干擾序列的設(shè)計(jì)及重組載體的構(gòu)建
        2.2 嗜熱毀絲霉原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化及陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的篩選鑒定
        2.3 ac基因的熒光定量分析
        2.4 纖維素酶活的測(cè)定
        2.5 主要纖維素酶基因的熒光定量分析
        2.6 磷酸二酯酶基因的熒光定量分析
    3.討論
    4.小結(jié)
第3章 外源添加cAMP對(duì)嗜熱毀絲霉纖維素酶活性的影響
    1.實(shí)驗(yàn)材料
        1.1 菌株
        1.2 培養(yǎng)基與試劑
        1.3 相關(guān)儀器
    2.實(shí)驗(yàn)方法
        2.1 cAMP試劑的配制
        2.2 外源添加cAMP
        2.3 嗜熱毀絲霉孢子懸浮液的制備
        2.4 纖維素酶活性的測(cè)定
            2.4.1 FPA酶活的測(cè)定
            2.4.2 CMC酶活的測(cè)定
            2.4.3 BG酶活的測(cè)定
        2.5 主要纖維素酶基因表達(dá)量的熒光定量分析
        2.6 嗜熱毀絲霉蛋白質(zhì)的提取
        2.7 iTRAQ操作步驟
    3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
        3.1 纖維素酶活性的測(cè)定結(jié)果
        3.2 主要纖維素酶基因表達(dá)量的熒光定量分析
        3.3 腺苷酸環(huán)化酶和磷酸二酯酶基因的熒光定量分析
        3.4 iTRAQ結(jié)果分析
            3.4.1 差異蛋白的生物學(xué)過(guò)程的分析
            3.4.2 差異蛋白的細(xì)胞成分的分析
            3.4.3 差異蛋白的分子功能的分析
            3.4.4 差異蛋白基因的Pathway富集分析
    4.討論
    5.小結(jié)
第4章 RNA干擾pde基因?qū)κ葻釟Ыz霉纖維素酶活性的影響
    1.實(shí)驗(yàn)材料與方法
        1.1 實(shí)驗(yàn)材料
            1.1.1 菌株與質(zhì)粒
            1.1.2 培養(yǎng)基與試劑
            1.1.3 相關(guān)儀器
            1.1.4 寡核苷酸引物
        1.2 實(shí)驗(yàn)方法
            1.2.1 pde基因siRNA寡核苷酸片段的設(shè)計(jì)及合成
            1.2.2 siRNA寡核苷酸片段的退火
            1.2.3 質(zhì)粒的提取及酶切
            1.2.4 pde siRNA寡核苷酸片段干擾表達(dá)載體的構(gòu)建
            1.2.5 嗜熱毀絲霉原生質(zhì)體的制備與轉(zhuǎn)化
            1.2.6 轉(zhuǎn)化子基因組DNA的提取及驗(yàn)證
            1.2.7 嗜熱毀絲霉總RNA的提取
            1.2.8 RT-qPCR
        1.3 纖維素酶活性的測(cè)定
            1.3.1 FPA酶活的測(cè)定
            1.3.2 CMC酶活的測(cè)定
            1.3.3 BG酶活的測(cè)定
        1.4 主要纖維素酶相關(guān)基因表達(dá)量的熒光定量分析
    2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
        2.1 pde基因干擾序列的設(shè)計(jì)及重組載體的構(gòu)建
        2.2 嗜熱毀絲霉原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化及陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的篩選
        2.3 pde基因的熒光定量分析
        2.4 酶活的測(cè)定
        2.5 主要纖維素酶基因的熒光定量分析
        2.6 腺苷酸環(huán)化酶基因的熒光定量分析
    3.討論
    4.小結(jié)
第5章 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
附錄
致謝
攻讀碩士學(xué)位期間的研究成果



本文編號(hào)：3157299