木質纖維素是規(guī)模最大、分布范圍最廣、含量最豐富的一類可再生資源。微生物產(chǎn)生的纖維素酶降解纖維素產(chǎn)生的葡萄糖,可進一步被轉化為乙醇等其它能源物質可以緩解目前的能源壓力。嗜熱毀絲霉能夠產(chǎn)生熱穩(wěn)定性的纖維素酶,被稱為潛在的高效中高溫酶庫。環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate,cAMP）是細胞內參與調節(jié)物質代謝和生物學功能的重要物質,是生物體內重要的第二信使。它能夠降低真菌的碳代謝阻遏效應從而提高真菌產(chǎn)纖維素酶的能力,而腺苷酸環(huán)化酶和磷酸二酯酶可共同調節(jié)細胞內的cAMP水平。本研究主要利用RNAi技術干擾嗜熱毀絲霉的腺苷酸環(huán)化酶和磷酸二酯酶基因的表達,及使用外源添加cAMP的方法,從多角度來研究cAMP及相關基因在嗜熱毀絲霉基因表達調控中的作用。本論文的主要內容如下:1)干擾腺苷酸環(huán)化酶基因方面:腺苷酸環(huán)化酶是細胞響應外界環(huán)境信號、調節(jié)胞內cAMP水平的關鍵酶,同時也是能夠催化ATP形成cAMP的唯一酶。本研究針對嗜熱毀絲霉腺苷酸環(huán)化酶ac基因設計干擾序列,利用pUC19-MtPpdc-MtTpdc質粒構建重組干擾表達載體。將干擾表達載體和pAN7-1質粒共... 

【文章來源】：深圳大學廣東省

【文章頁數(shù)】：72 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第1章 緒論
    1.纖維素酶概述
    2.嗜熱毀絲霉概述
    3.cAMP在真菌產(chǎn)酶中的研究概況
        3.1 cAMP概述
        3.2 cAMP在真菌產(chǎn)酶中的研究進展
    4.碳代謝阻遏效應
    5.RNA干擾技術在真菌中的應用
    6.iTRAQ技術
    7.本文的主要研究內容和意義
第2章 RNA干擾嗜熱毀絲霉腺苷酸環(huán)化酶基因對纖維素酶活性的影響
    1.實驗材料和方法
        1.1 實驗材料
            1.1.1 菌株與質粒
            1.1.2 培養(yǎng)基與試劑
            1.1.3 相關儀器和設備
            1.1.4 寡核苷酸引物
        1.2 實驗方法
            1.2.1 腺苷酸環(huán)化酶基因ac的 siRNA寡核苷酸片段的設計及合成
            1.2.2 siRNA寡核苷酸片段退火
            1.2.3 質粒提取及酶切
            1.2.4 腺苷酸環(huán)化酶基因干擾表達載體構建
            1.2.5 嗜熱毀絲霉原生質體制備與轉化
            1.2.6 轉化子基因組DNA提取及驗證
            1.2.7 嗜熱毀絲霉總RNA提取
            1.2.8 RT-qPCR
        1.3 纖維素酶活性的測定
            1.3.1 FPA酶活的測定
            1.3.2 CMC酶活的測定
            1.3.3 BG酶活的測定
    2.實驗結果與分析
        2.1 ac干擾序列的設計及重組載體的構建
        2.2 嗜熱毀絲霉原生質體轉化及陽性轉化子的篩選鑒定
        2.3 ac基因的熒光定量分析
        2.4 纖維素酶活的測定
        2.5 主要纖維素酶基因的熒光定量分析
        2.6 磷酸二酯酶基因的熒光定量分析
    3.討論
    4.小結
第3章 外源添加cAMP對嗜熱毀絲霉纖維素酶活性的影響
    1.實驗材料
        1.1 菌株
        1.2 培養(yǎng)基與試劑
        1.3 相關儀器
    2.實驗方法
        2.1 cAMP試劑的配制
        2.2 外源添加cAMP
        2.3 嗜熱毀絲霉孢子懸浮液的制備
        2.4 纖維素酶活性的測定
            2.4.1 FPA酶活的測定
            2.4.2 CMC酶活的測定
            2.4.3 BG酶活的測定
        2.5 主要纖維素酶基因表達量的熒光定量分析
        2.6 嗜熱毀絲霉蛋白質的提取
        2.7 iTRAQ操作步驟
    3.實驗結果與分析
        3.1 纖維素酶活性的測定結果
        3.2 主要纖維素酶基因表達量的熒光定量分析
        3.3 腺苷酸環(huán)化酶和磷酸二酯酶基因的熒光定量分析
        3.4 iTRAQ結果分析
            3.4.1 差異蛋白的生物學過程的分析
            3.4.2 差異蛋白的細胞成分的分析
            3.4.3 差異蛋白的分子功能的分析
            3.4.4 差異蛋白基因的Pathway富集分析
    4.討論
    5.小結
第4章 RNA干擾pde基因對嗜熱毀絲霉纖維素酶活性的影響
    1.實驗材料與方法
        1.1 實驗材料
            1.1.1 菌株與質粒
            1.1.2 培養(yǎng)基與試劑
            1.1.3 相關儀器
            1.1.4 寡核苷酸引物
        1.2 實驗方法
            1.2.1 pde基因siRNA寡核苷酸片段的設計及合成
            1.2.2 siRNA寡核苷酸片段的退火
            1.2.3 質粒的提取及酶切
            1.2.4 pde siRNA寡核苷酸片段干擾表達載體的構建
            1.2.5 嗜熱毀絲霉原生質體的制備與轉化
            1.2.6 轉化子基因組DNA的提取及驗證
            1.2.7 嗜熱毀絲霉總RNA的提取
            1.2.8 RT-qPCR
        1.3 纖維素酶活性的測定
            1.3.1 FPA酶活的測定
            1.3.2 CMC酶活的測定
            1.3.3 BG酶活的測定
        1.4 主要纖維素酶相關基因表達量的熒光定量分析
    2.實驗結果與分析
        2.1 pde基因干擾序列的設計及重組載體的構建
        2.2 嗜熱毀絲霉原生質體轉化及陽性轉化子的篩選
        2.3 pde基因的熒光定量分析
        2.4 酶活的測定
        2.5 主要纖維素酶基因的熒光定量分析
        2.6 腺苷酸環(huán)化酶基因的熒光定量分析
    3.討論
    4.小結
第5章 結論
參考文獻
附錄
致謝
攻讀碩士學位期間的研究成果



本文編號：3157299