木麻黃（Casuarina）是優(yōu)良的沿海防護林樹種。其中Casuarina equisetifolia（屬于短枝木麻黃的一種）的基因組最近測序完成,使得木麻黃具有了成為耐鹽模式樹種的潛力,也亟需開發(fā)其轉(zhuǎn)基因體系為分子研究服務(wù)。然而現(xiàn)有的轉(zhuǎn)基因體系僅限于輪生木麻黃、細枝木麻黃、粗枝木麻黃,且其方法均不適用于Casuarina equisetifolia。本研究使用測序木麻黃（Casuarina equisetifolia）的幼嫩枝條為研究材料,建立了快速、高效的愈傷組織再生體系,并在此基礎(chǔ)上初步確立了農(nóng)桿菌介導的木麻黃遺傳轉(zhuǎn)化條件。同時,我們對CRISPR/Cas9系統(tǒng)sgRNA序列單堿基錯配進行了分析,為將來敲除測序木麻黃基因時sgRNA的設(shè)計提供了理論依據(jù)。主要研究結(jié)果如下:1、木麻黃幼嫩枝條愈傷組織再生體系:（1）兩步法暗培養(yǎng)誘導愈傷組織,首先在1/2MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加0.1 mg·L^-1NAA和0.1 mg·L^-1 TDZ誘導愈傷組織產(chǎn)生,愈傷組織誘導率為99.33%;再在1/2MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加0.5 mg·L^-1

【文章來源】：浙江農(nóng)林大學浙江省

【文章頁數(shù)】：68 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 前言
    1.1 研究背景
        1.1.1 木麻黃簡述
        1.1.2 林木的轉(zhuǎn)基因研究概況
        1.1.3 木麻黃基因工程研究
            1.1.3.1 木麻黃無性繁殖再生研究
            1.1.3.2 木麻黃轉(zhuǎn)基因研究
        1.1.4 植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)概述
            1.1.4.1 基因槍技術(shù)
            1.1.4.2 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化技術(shù)
    1.2 目的和意義
    1.3 主要研究內(nèi)容
        1.3.1 構(gòu)建木麻黃愈傷組織再生體系
        1.3.2 構(gòu)建木麻黃遺傳轉(zhuǎn)化體系
        1.3.3 木麻黃轉(zhuǎn)基因植株的鑒定
        1.3.4 木麻黃內(nèi)源耐鹽基因的遺傳轉(zhuǎn)化
    1.4 技術(shù)路線
第二章 建立愈傷組織再生體系
    2.1 材料與方法
        2.1.1 材料
            2.1.1.1 植物材料
            2.1.1.2 培養(yǎng)基、試劑和儀器
        2.1.2 方法
            2.1.2.1 外植體的獲取與處理
            2.1.2.2 愈傷組織、不定芽及不定根誘導培養(yǎng)
            2.1.2.3 不定芽的生根培養(yǎng)
            2.1.2.4 再生苗的移栽、馴化
            2.1.2.5 試驗現(xiàn)象的觀察記錄及數(shù)據(jù)的收集處理
    2.2 結(jié)果分析
        2.2.1 愈傷組織的誘導與增殖
        2.2.2 不定芽的誘導
        2.2.3 不定芽生根
    2.3 討論
        2.3.1 誘導愈傷組織的不同外植體的優(yōu)缺點
        2.3.2 兩種不同基礎(chǔ)培養(yǎng)基對再生體系的影響
        2.3.3 植物生長調(diào)節(jié)劑對愈傷組織誘導的影響
    2.4 小結(jié)
第三章 木麻黃農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化體系的初步建立
    3.1 材料與方法
        3.1.1 材料
            3.1.1.1 受體材料
            3.1.1.2 菌株和質(zhì)粒
            3.1.1.3 培養(yǎng)基
            3.1.1.4 試劑和儀器
        3.1.2 方法
            3.1.2.1 As和抗生素的配制和使用
            3.1.2.2 農(nóng)桿菌C58C1和GV3101感受態(tài)的制備與
            3.1.2.3 目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌C58C1和GV
            3.1.2.4 農(nóng)桿菌侵染液的制備（無菌操作）
            3.1.2.5 農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化的基本步驟
            3.1.2.6 抗生素敏感性試驗
            3.1.2.7 木麻黃遺傳轉(zhuǎn)化效率影響因素試驗設(shè)計
            3.1.2.8 gus基因化學組織染色
        3.1.3 試驗現(xiàn)象的觀察記錄及數(shù)據(jù)的收集處理
    3.2 結(jié)果分析
        3.2.1 工程菌株與共培養(yǎng)時間的選擇
        3.2.2 Car對農(nóng)桿菌的生長抑制性
        3.2.3 Hyg篩選體系中培養(yǎng)條件的研究
            3.2.3.1 受體材料對潮霉素的耐受性
            3.2.3.2 Hyg篩選過程中As的使用
        3.2.4 Kan篩選體系中培養(yǎng)條件的研究
            3.2.4.1 受體材料對Kan的耐受性
            3.2.4.2 Kan篩選體系中As的使用
    3.3 討論
    3.4 小結(jié)
第四章 轉(zhuǎn)基因表達載體的構(gòu)建
    4.1 木麻黃CeNCS2基因過表達載體構(gòu)建
        4.1.1 材料和試劑
            4.1.1.1 植物材料
            4.1.1.2 試劑和儀器
            4.1.1.3 菌株和載體
        4.1.2 試驗方法
            4.1.2.1 木麻黃總RNA提取
            4.1.2.2 木麻黃cDNA合成
            4.1.2.3 CeNCS2基因克隆
            4.1.2.4 目的基因體外擴增
            4.1.2.5 大腸桿菌DH5α感受態(tài)制備
            4.1.2.6 外源片段連接和大腸桿菌轉(zhuǎn)化
            4.1.2.7 陽性克隆篩選、菌檢、測序及質(zhì)粒提取
            4.1.2.8 雙酶切反應(yīng)
    4.2 木麻黃CeNCS2基因過表達載體構(gòu)建結(jié)果
        4.2.1 木麻黃總RNA質(zhì)量檢測
        4.2.2 CeNCS2基因克隆（PCR和測序結(jié)果）
        4.2.3 雙酶切載體構(gòu)建（PCR和測序結(jié)果）
    4.3 木麻黃CeSnRK2基因家族敲除載體構(gòu)建
        4.2.1 材料與試劑
        4.2.2 方法
    4.4 木麻黃CeSnRK2基因家族敲除載體構(gòu)建結(jié)果
    4.5 小結(jié)與討論
第五章 CRISPR/CAS9系統(tǒng)SGRNA序列單堿基錯配研究
    5.1 材料與方法
        5.1.1 材料
        5.1.2 方法
    5.2 結(jié)果分析
        5.2.1 水稻MIR156a、MIR156b和MIR156c的基因編輯
        5.2.2 水稻DST的基因編輯
    5.3 討論與小結(jié)
第六章 總結(jié)和展望
    6.1 結(jié)論
        6.1.1 木麻黃愈傷組織再生體系
        6.1.2 木麻黃遺傳轉(zhuǎn)化體系
        6.1.3 木麻黃基因表達載體的構(gòu)建
        6.1.4 CRISPR/Cas9系統(tǒng)sgRNA序列單堿基錯配研究
    6.2 討論
    6.3 展望
參考文獻
附錄1
附錄2
附錄3 縮寫詞表
個人簡介
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
[1]浙江省海岸線分類保護和圍填海分類管理[J]. 陳甫源,王琪,曾劍,韓宇.  海洋開發(fā)與管理. 2018(06)
[2]低溫脅迫下短枝木麻黃耐寒相關(guān)基因的差異表達分析[J]. 李楠,鄭勇奇,丁紅梅,柳新紅,盛煒彤,江波,李海波.  林業(yè)科學. 2017(07)
[3]木麻黃無性系苗期耐寒性研究[J]. 何貴平,陳雨春,陳炳,譚君琴,袁杰,王濤.  江西農(nóng)業(yè)大學學報. 2015(03)
[4]細枝木麻黃離體培養(yǎng)過程中愈傷組織和再生芽的細胞組織學觀察[J]. 姜清彬,仲崇祿,陳羽,劉芬,張勇,陳珍.  熱帶亞熱帶植物學報. 2015(01)
[5]粗枝木麻黃在海南的種源試驗與早期選擇[J]. 馬妮,張勇,仲崇祿,姜清彬,陳羽,陳珍,胡盼,王仁開.  林業(yè)科學研究. 2014(03)
[6]細枝木麻黃組織培養(yǎng)和轉(zhuǎn)基因研究[J]. 林永生,蔣晶,喬桂榮,李海營,邱文敏,卓仁英.  安徽農(nóng)業(yè)科學. 2012(03)
[7]木麻黃共生固氮菌Frankia的分離鑒定及固氮效應(yīng)[J]. 張昕,馬新穎,王秋芹,陳友吾,林海萍,馬良進.  生態(tài)學雜志. 2011(09)
[8]低溫處理對耐寒粗枝木麻黃無性系生理指標的影響[J]. 何貴平,卓仁英,陳雨春,黃一青,彭柳青.  林業(yè)科學研究. 2011(04)
[9]抗生素對細枝木麻黃愈傷組織再生及農(nóng)桿菌生長的影響[J]. 姜清彬,仲崇祿,曾炳山,張勇,Didier Bogusz,Claudine Franche.  東北林業(yè)大學學報. 2010(09)
[10]發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒T-DNA對杜仲的遺傳轉(zhuǎn)化研究[J]. 王躍華,孫雁霞,吳潔,閻文昭,徐作英,張海強.  西南農(nóng)業(yè)學報. 2008(01)

博士論文
[1]細枝木麻黃再生體系及農(nóng)桿菌介導遺傳轉(zhuǎn)化研究[D]. 姜清彬.中國林業(yè)科學研究院 2011
[2]樟樹體細胞胚再生體系的優(yōu)化和轉(zhuǎn)化Barnase、PaFT基因的研究[D]. 施雪萍.華中農(nóng)業(yè)大學 2009

碩士論文
[1]枇杷高頻率體胚發(fā)生體系的建立及其遺傳轉(zhuǎn)化初步研究[D]. 沈慶斌.福建農(nóng)林大學 2005



本文編號：3154993