幾丁質(zhì)酶作為生物指示物,常常用于農(nóng)藥水生生態(tài)風(fēng)險評估,尤其是用于評估農(nóng)藥對甲殼類動物種群發(fā)育的影響。介形蟲是浮游動物的重要組成部分,尤其是底棲節(jié)肢動物中最常見的物種。介形蟲的種群豐度,在一定程度上,往往能夠揭示出某一水域的健康狀況。已有研究表明,水域中幾丁質(zhì)酶的含量與浮游節(jié)肢動物的種群豐度具有相關(guān)性。為了高效、便捷、專一的測量水域中介形蟲幾丁質(zhì)酶含量,我們需要開發(fā)出能特異性識別介形蟲幾丁質(zhì)酶的抗體。本文首先利用RT-PCR技術(shù)和RACE技術(shù),從中華薄殼介體內(nèi)克隆獲得幾丁質(zhì)酶（Chitinase）基因的cDNA和gDNA全長序列。結(jié)果顯示,中華薄殼介幾丁質(zhì)酶基因（DsChi）由10個外顯子和9個內(nèi)含子構(gòu)成,開放閱讀框為1821bp,編碼606個氨基酸。再通過雙酶切技術(shù),將目的基因與表達(dá)載體（pET-30a（+））連接,成功構(gòu)建出重組表達(dá)載體。重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌后,陽性菌株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng),表達(dá)得到了重組幾丁質(zhì)酶蛋白。以純化的重組幾丁質(zhì)酶蛋白為免疫原,免疫新西蘭白兔,成功制備了兔抗中華薄殼介重組幾丁質(zhì)酶抗血清,經(jīng)過純化得到了抗體球蛋白,經(jīng)ELISA檢測,抗體對重組幾丁質(zhì)酶蛋白的效價... 

【文章來源】：浙江大學(xué)浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：67 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
術(shù)語與縮略語列表
第一章 研究綜述
    1.1 本文研究背景
    1.2 幾丁質(zhì)酶研究進(jìn)展
        1.2.1 幾丁質(zhì)
        1.2.2 幾丁質(zhì)的水解
        1.2.3 幾丁質(zhì)酶的研究概況
    1.3 介形蟲研究進(jìn)展
    1.4 幾丁質(zhì)酶的分子克隆
    1.5 抗原的制備
    1.6 抗體的制備
    1.7 酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）
    1.8 本文主要研究內(nèi)容
第二章 中華薄殼介幾丁質(zhì)酶的克隆
    2.1 引言
    2.2 材料與方法
        2.2.1 實驗材料
        2.2.2 中間片段的基因克隆
        2.2.3 全長序列的RACE擴(kuò)增
        2.2.4 中華薄殼介gDNA的擴(kuò)增
        2.2.5 序列分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建
    2.3 結(jié)果與分析
        2.3.1 總RNA的提取
        2.3.2 目的基因序列的獲得
        2.3.3 基因結(jié)構(gòu)
        2.3.4 氨基酸結(jié)構(gòu)分析
        2.3.5 多重序列比對分析
        2.3.6 進(jìn)化樹構(gòu)建
    2.4 討論
第三章 中華薄殼介幾丁質(zhì)酶基因的表達(dá)與純化
    3.1 引言
    3.2 材料與方法
        3.2.1 實驗試劑
        3.2.2 實驗儀器與設(shè)備
        3.2.3 實驗方法
    3.3 結(jié)果與分析
        3.3.1 重組質(zhì)粒鑒定結(jié)果
        3.3.2 表達(dá)結(jié)果鑒定
        3.3.3 上清中親和層析純化幾丁質(zhì)酶蛋白鑒定結(jié)果
        3.3.4 包涵體通過親和層析純化幾丁質(zhì)酶蛋白
        3.3.5 蛋白濃度鑒定
        3.3.6 蛋白WB檢測
    3.4 討論
第四章 介形蟲重組幾丁質(zhì)酶多克隆抗體的制備
    4.1 引言
    4.2 材料與方法
        4.2.1 實驗材料
        4.2.2 實驗方法
    4.3 結(jié)果與分析
        4.3.1 抗體制備結(jié)果檢測
        4.3.2 確定最適抗原抗體工作濃度
        4.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線
    4.4 討論
第五章 中華薄殼介幾丁質(zhì)酶多克隆抗體抗體特異性研究
    5.1 引言
    5.2 材料與方法
        5.2.1 實驗材料
        5.2.2 實驗方法
    5.3 結(jié)果與分析
    5.4 討論
第六章 總結(jié)與展望
    6.1 總結(jié)
    6.2 主要創(chuàng)新點(diǎn)
    6.3 不足與展望
參考文獻(xiàn)
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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本文編號：3155149