幾丁質(zhì)酶作為生物指示物,常常用于農(nóng)藥水生生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估,尤其是用于評(píng)估農(nóng)藥對(duì)甲殼類(lèi)動(dòng)物種群發(fā)育的影響。介形蟲(chóng)是浮游動(dòng)物的重要組成部分,尤其是底棲節(jié)肢動(dòng)物中最常見(jiàn)的物種。介形蟲(chóng)的種群豐度,在一定程度上,往往能夠揭示出某一水域的健康狀況。已有研究表明,水域中幾丁質(zhì)酶的含量與浮游節(jié)肢動(dòng)物的種群豐度具有相關(guān)性。為了高效、便捷、專(zhuān)一的測(cè)量水域中介形蟲(chóng)幾丁質(zhì)酶含量,我們需要開(kāi)發(fā)出能特異性識(shí)別介形蟲(chóng)幾丁質(zhì)酶的抗體。本文首先利用RT-PCR技術(shù)和RACE技術(shù),從中華薄殼介體內(nèi)克隆獲得幾丁質(zhì)酶（Chitinase）基因的cDNA和gDNA全長(zhǎng)序列。結(jié)果顯示,中華薄殼介幾丁質(zhì)酶基因（DsChi）由10個(gè)外顯子和9個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成,開(kāi)放閱讀框?yàn)?821bp,編碼606個(gè)氨基酸。再通過(guò)雙酶切技術(shù),將目的基因與表達(dá)載體（pET-30a（+））連接,成功構(gòu)建出重組表達(dá)載體。重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌后,陽(yáng)性菌株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng),表達(dá)得到了重組幾丁質(zhì)酶蛋白。以純化的重組幾丁質(zhì)酶蛋白為免疫原,免疫新西蘭白兔,成功制備了兔抗中華薄殼介重組幾丁質(zhì)酶抗血清,經(jīng)過(guò)純化得到了抗體球蛋白,經(jīng)ELISA檢測(cè),抗體對(duì)重組幾丁質(zhì)酶蛋白的效價(jià)... 

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
術(shù)語(yǔ)與縮略語(yǔ)列表
第一章 研究綜述
    1.1 本文研究背景
    1.2 幾丁質(zhì)酶研究進(jìn)展
        1.2.1 幾丁質(zhì)
        1.2.2 幾丁質(zhì)的水解
        1.2.3 幾丁質(zhì)酶的研究概況
    1.3 介形蟲(chóng)研究進(jìn)展
    1.4 幾丁質(zhì)酶的分子克隆
    1.5 抗原的制備
    1.6 抗體的制備
    1.7 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）
    1.8 本文主要研究?jī)?nèi)容
第二章 中華薄殼介幾丁質(zhì)酶的克隆
    2.1 引言
    2.2 材料與方法
        2.2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.2.2 中間片段的基因克隆
        2.2.3 全長(zhǎng)序列的RACE擴(kuò)增
        2.2.4 中華薄殼介gDNA的擴(kuò)增
        2.2.5 序列分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建
    2.3 結(jié)果與分析
        2.3.1 總RNA的提取
        2.3.2 目的基因序列的獲得
        2.3.3 基因結(jié)構(gòu)
        2.3.4 氨基酸結(jié)構(gòu)分析
        2.3.5 多重序列比對(duì)分析
        2.3.6 進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建
    2.4 討論
第三章 中華薄殼介幾丁質(zhì)酶基因的表達(dá)與純化
    3.1 引言
    3.2 材料與方法
        3.2.1 實(shí)驗(yàn)試劑
        3.2.2 實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備
        3.2.3 實(shí)驗(yàn)方法
    3.3 結(jié)果與分析
        3.3.1 重組質(zhì)粒鑒定結(jié)果
        3.3.2 表達(dá)結(jié)果鑒定
        3.3.3 上清中親和層析純化幾丁質(zhì)酶蛋白鑒定結(jié)果
        3.3.4 包涵體通過(guò)親和層析純化幾丁質(zhì)酶蛋白
        3.3.5 蛋白濃度鑒定
        3.3.6 蛋白WB檢測(cè)
    3.4 討論
第四章 介形蟲(chóng)重組幾丁質(zhì)酶多克隆抗體的制備
    4.1 引言
    4.2 材料與方法
        4.2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        4.2.2 實(shí)驗(yàn)方法
    4.3 結(jié)果與分析
        4.3.1 抗體制備結(jié)果檢測(cè)
        4.3.2 確定最適抗原抗體工作濃度
        4.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線
    4.4 討論
第五章 中華薄殼介幾丁質(zhì)酶多克隆抗體抗體特異性研究
    5.1 引言
    5.2 材料與方法
        5.2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        5.2.2 實(shí)驗(yàn)方法
    5.3 結(jié)果與分析
    5.4 討論
第六章 總結(jié)與展望
    6.1 總結(jié)
    6.2 主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)
    6.3 不足與展望
參考文獻(xiàn)
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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