研究背景:在世界范圍內(nèi),金黃色葡萄球菌是引起重癥肺炎和菌血癥等醫(yī)院內(nèi)侵襲性感染的重要病原體,同時也是社區(qū)獲得性感染的主要病原體之一。隨著臨床治療中抗生素越來越頻繁的使用,出現(xiàn)了大量具有多重耐藥性的“超級病菌”,即耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA）。MRSA在臨床患者中的大量出現(xiàn)直接導致其治療更為困難。近年來的研究發(fā)現(xiàn),攜帶殺傷白細胞素（pvl）基因的MRSA菌毒力更強危害更廣,可以造成嚴重的社區(qū)內(nèi)感染,并嚴重危及感染者生命,由其引起的壞死性肺炎的死亡率可達75%。目前臨床對于攜帶pvl基因的MRSA菌尚無快速鑒定方法,非常不利于感染者的及時診斷和治療,因此建立相關(guān)快速檢測技術(shù)極具臨床價值。目前對于攜帶pvl基因的MRSA菌的致病機制仍不明晰,通過其致病機制的研究可以為臨床治療提供新的思路。研究目的:1.建立攜帶pvl基因的MRSA菌的快速檢測技術(shù);2.研究攜帶pvl基因的MRSA菌誘導巨噬細胞（THP-1細胞）自噬、凋亡和焦亡機制;3.研究攜帶pvl基因的MRSA菌誘導上皮細胞（A549細胞）的... 

【文章來源】：江蘇大學江蘇省

【文章頁數(shù)】：93 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
常用縮寫詞中英文對照表
第一章 緒論
    1.1 耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌研究進展
    1.2 殺白細胞素
    1.3 LAMP
    1.4 細胞自噬
    1.5 細胞焦亡
    1.6 細胞凋亡
    1.7 核因子kappa B（NF-κB）
    1.8 研究目的
    1.9 研究內(nèi)容
    1.10 研究方法
    1.11 實驗設計
    1.12 研究意義
第二章 建立攜帶pvl基因的MRSA菌快速檢測方法
    2.1 實驗材料和試劑
        2.1.1 實驗耗材
        2.1.2 培養(yǎng)基和常用試劑配制
        2.1.3 實驗儀器
        2.1.4 引物序列
    2.2 實驗方法
        2.2.1 堿裂解法提取金黃色葡萄球菌基因組DNA
        2.2.2 PCR法檢測spa、mec A、femB和 pvl基因
        2.2.3 LAMP法檢測spa、mec A基因
        2.2.4 重組LukS-PV蛋白表達純化
        2.2.5 制備LukS-PV多克隆抗體
        2.2.6 Western blotting法檢測PVL表達
            2.2.6.1 制備蛋白沉淀
            2.2.6.2 Western blotting
    2.3 結(jié)果
        2.3.1 PCR法檢測spa、mec A、femB和 pvl基因
        2.3.2 LAMP法檢測spa和 mec A基因
        2.3.3 LukS-PV蛋白多克隆抗體制備
            2.3.3.1 LukS-PV蛋白的表達與純化
            2.3.3.2 多克隆抗體制備
            2.3.3.3 Western blotting法檢測PVL表達
    2.4 討論
第三章 PVL誘導THP-1 細胞和A549 細胞自噬、凋亡和焦亡的研究
    3.1 實驗材料和試劑
        3.1.1 實驗材料
            3.1.1.1 菌株和細胞
            3.1.1.2 實驗耗材
        3.1.2 試劑配制
        3.1.3 實驗儀器
        3.1.4 引物序列
    3.2 實驗方法
        3.2.1 PCR法檢測mec A和 pvl基因
        3.2.2 Western blotting法檢測PVL表達
        3.2.3 細菌-細胞共培養(yǎng)
            3.2.3.1 細胞培養(yǎng)
            3.2.3.2 金黃色葡萄球菌-細胞共培養(yǎng)
        3.2.4 Real-time PCR法檢測基因表達
            3.2.4.1 提取細胞RNA并逆轉(zhuǎn)錄cDNA
            3.2.4.2 Real-time PCR法
        3.2.5 Western blotting法檢測蛋白表達
            3.2.5.1 提取細胞總蛋白
            3.2.5.2 Western blotting
        3.2.6 Annexin V-FITC/PI法檢測細胞凋亡
        3.2.7 統(tǒng)計分析
    3.3 實驗結(jié)果
        3.3.1 MRSA菌株mec A基因和pvl基因檢測
        3.3.2 Western blotting法檢測細胞自噬相關(guān)蛋白的表達
            3.3.2.1 THP-1 細胞LC-3和Beclin-1 蛋白的表達升高
            3.3.2.2 A-549 細胞LC-3和Beclin-1 蛋白的表達無差異
        3.3.3 THP-1 細胞自噬相關(guān)基因atg7和atg12 表達升高
        3.3.4 Western blotting法檢測Caspase-3 活化程度
            3.3.4.1 THP-1 細胞Caspase-3 蛋白活化程度升高
            3.3.4.2 A549 細胞Caspase-3 蛋白活化程度升高
PVL+株和MRSA^PVL-株細菌誘導THP-1 細胞和A549 細胞凋亡能力">        3.3.5 MRSA^PVL+株和MRSA^PVL-株細菌誘導THP-1 細胞和A549 細胞凋亡能力
            3.3.5.1 THP-1細胞凋亡率升高
            3.3.5.2 A549細胞凋亡率升高
    3.4 討論
第四章 金黃色葡萄球菌PVL誘導THP-1 細胞自噬、凋亡和焦亡機制研究
    4.1 實驗材料和試劑
        4.1.1 實驗材料
            4.1.1.1 菌株和細胞
            4.1.1.2 試劑
        4.1.2 試劑配方
        4.1.3 實驗儀器
        4.1.4 引物序列
    4.2 實驗方法
        4.2.1 TLR-2、TLR-4 基因,NLRP3 炎癥小體相關(guān)基因以及炎癥因子相關(guān)基因檢測
        4.2.2 NF-κB信號通路活化
        4.2.3 PI3K/AKT/m-TOR信號通路的活化
        4.2.4 NLRP3炎癥小體相關(guān)蛋白的活化
        4.2.5 檢測THP-1細胞活性氧表達
        4.2.6 siRNA法抑制THP-1 細胞NLRP3 表達
        4.2.7 Western blotting法檢測轉(zhuǎn)染后細胞NLRP3、GSDMD、Caspase-1、Beclin-1、LC3和Caspase-3和Cleaved Caspase-3 表達
    4.3 實驗結(jié)果
        4.3.1 MRSA菌誘導THP-1 細胞多種細胞因子表達量升高
        4.3.2 NLRP3炎癥復合體相關(guān)基因的表達量升高
        4.3.3 THP-1 細胞TLR-2和TLR-4 基因表達量升高
        4.3.4 NF-κB信號通路的活化
        4.3.5 THP-1 細胞PI3K/Akt/m-TOR信號通路的活化
        4.3.6 Western blotting法檢測THP-1 細胞NLRP3 炎癥復合體相關(guān)蛋白表達
        4.3.7 THP-1 細胞ROS表達量升高
        4.3.8 轉(zhuǎn)染siRNA-NLRP3后THP-1 細胞相關(guān)蛋白表達變化
    4.4 討論
第五章 金黃色葡萄球菌PVL誘導A549細胞自噬、凋亡和程序性壞死的研究
    5.1 實驗材料和試劑
        5.1.1 實驗材料
            5.1.1.1 菌株和細胞
            5.1.1.2 試劑
        5.1.2 試劑配方
        5.1.3 實驗儀器
    5.2 實驗方法
        5.2.1 細胞-細菌共培養(yǎng)
        5.2.2 檢測A549細胞活性氧的表達
    5.3 實驗結(jié)果
        5.3.1 A549細胞ROS表達升高
    5.4 討論
第六章 總結(jié)與思考
    6.1 實驗總結(jié)
    6.2 思考與展望
參考文獻
致謝
在學期間發(fā)表的學術(shù)論文及其他科研成果


【參考文獻】：
期刊論文
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[3]Autophagy and inflammation in ischemic stroke[J]. Yun Mo,Yin-Yi Sun,Kang-Yong Liu.  Neural Regeneration Research. 2020(08)
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[6]銅綠假單胞菌LAMP快速檢測方法建立及微滴數(shù)字PCR驗證[J]. 李羽翡,祖新,李羽翠,張德榮.  食品工業(yè)科技. 2020(11)
[7]活性氧在GDC-0152誘導NB4細胞凋亡和自噬中的作用[J]. 李川,姜薇,劉卓剛,梁佩淇,胡榮.  中國實驗血液學雜志. 2019(06)
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[10]一例犬耐甲氧西林金黃色葡萄球菌感染的診斷[J]. 李曄,趙景利,劉華勇.  獸醫(yī)導刊. 2019(19)



本文編號：3154492