研究背景:在世界范圍內(nèi),金黃色葡萄球菌是引起重癥肺炎和菌血癥等醫(yī)院內(nèi)侵襲性感染的重要病原體,同時(shí)也是社區(qū)獲得性感染的主要病原體之一。隨著臨床治療中抗生素越來越頻繁的使用,出現(xiàn)了大量具有多重耐藥性的“超級病菌”,即耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA）。MRSA在臨床患者中的大量出現(xiàn)直接導(dǎo)致其治療更為困難。近年來的研究發(fā)現(xiàn),攜帶殺傷白細(xì)胞素（pvl）基因的MRSA菌毒力更強(qiáng)危害更廣,可以造成嚴(yán)重的社區(qū)內(nèi)感染,并嚴(yán)重危及感染者生命,由其引起的壞死性肺炎的死亡率可達(dá)75%。目前臨床對于攜帶pvl基因的MRSA菌尚無快速鑒定方法,非常不利于感染者的及時(shí)診斷和治療,因此建立相關(guān)快速檢測技術(shù)極具臨床價(jià)值。目前對于攜帶pvl基因的MRSA菌的致病機(jī)制仍不明晰,通過其致病機(jī)制的研究可以為臨床治療提供新的思路。研究目的:1.建立攜帶pvl基因的MRSA菌的快速檢測技術(shù);2.研究攜帶pvl基因的MRSA菌誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞（THP-1細(xì)胞）自噬、凋亡和焦亡機(jī)制;3.研究攜帶pvl基因的MRSA菌誘導(dǎo)上皮細(xì)胞（A549細(xì)胞）的... 

【文章來源】：江蘇大學(xué)江蘇省

【文章頁數(shù)】：93 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
常用縮寫詞中英文對照表
第一章 緒論
    1.1 耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌研究進(jìn)展
    1.2 殺白細(xì)胞素
    1.3 LAMP
    1.4 細(xì)胞自噬
    1.5 細(xì)胞焦亡
    1.6 細(xì)胞凋亡
    1.7 核因子kappa B（NF-κB）
    1.8 研究目的
    1.9 研究內(nèi)容
    1.10 研究方法
    1.11 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
    1.12 研究意義
第二章 建立攜帶pvl基因的MRSA菌快速檢測方法
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料和試劑
        2.1.1 實(shí)驗(yàn)耗材
        2.1.2 培養(yǎng)基和常用試劑配制
        2.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器
        2.1.4 引物序列
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 堿裂解法提取金黃色葡萄球菌基因組DNA
        2.2.2 PCR法檢測spa、mec A、femB和 pvl基因
        2.2.3 LAMP法檢測spa、mec A基因
        2.2.4 重組LukS-PV蛋白表達(dá)純化
        2.2.5 制備LukS-PV多克隆抗體
        2.2.6 Western blotting法檢測PVL表達(dá)
            2.2.6.1 制備蛋白沉淀
            2.2.6.2 Western blotting
    2.3 結(jié)果
        2.3.1 PCR法檢測spa、mec A、femB和 pvl基因
        2.3.2 LAMP法檢測spa和 mec A基因
        2.3.3 LukS-PV蛋白多克隆抗體制備
            2.3.3.1 LukS-PV蛋白的表達(dá)與純化
            2.3.3.2 多克隆抗體制備
            2.3.3.3 Western blotting法檢測PVL表達(dá)
    2.4 討論
第三章 PVL誘導(dǎo)THP-1 細(xì)胞和A549 細(xì)胞自噬、凋亡和焦亡的研究
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料和試劑
        3.1.1 實(shí)驗(yàn)材料
            3.1.1.1 菌株和細(xì)胞
            3.1.1.2 實(shí)驗(yàn)耗材
        3.1.2 試劑配制
        3.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器
        3.1.4 引物序列
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 PCR法檢測mec A和 pvl基因
        3.2.2 Western blotting法檢測PVL表達(dá)
        3.2.3 細(xì)菌-細(xì)胞共培養(yǎng)
            3.2.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)
            3.2.3.2 金黃色葡萄球菌-細(xì)胞共培養(yǎng)
        3.2.4 Real-time PCR法檢測基因表達(dá)
            3.2.4.1 提取細(xì)胞RNA并逆轉(zhuǎn)錄cDNA
            3.2.4.2 Real-time PCR法
        3.2.5 Western blotting法檢測蛋白表達(dá)
            3.2.5.1 提取細(xì)胞總蛋白
            3.2.5.2 Western blotting
        3.2.6 Annexin V-FITC/PI法檢測細(xì)胞凋亡
        3.2.7 統(tǒng)計(jì)分析
    3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.3.1 MRSA菌株mec A基因和pvl基因檢測
        3.3.2 Western blotting法檢測細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)
            3.3.2.1 THP-1 細(xì)胞LC-3和Beclin-1 蛋白的表達(dá)升高
            3.3.2.2 A-549 細(xì)胞LC-3和Beclin-1 蛋白的表達(dá)無差異
        3.3.3 THP-1 細(xì)胞自噬相關(guān)基因atg7和atg12 表達(dá)升高
        3.3.4 Western blotting法檢測Caspase-3 活化程度
            3.3.4.1 THP-1 細(xì)胞Caspase-3 蛋白活化程度升高
            3.3.4.2 A549 細(xì)胞Caspase-3 蛋白活化程度升高
PVL+株和MRSA^PVL-株細(xì)菌誘導(dǎo)THP-1 細(xì)胞和A549 細(xì)胞凋亡能力">        3.3.5 MRSA^PVL+株和MRSA^PVL-株細(xì)菌誘導(dǎo)THP-1 細(xì)胞和A549 細(xì)胞凋亡能力
            3.3.5.1 THP-1細(xì)胞凋亡率升高
            3.3.5.2 A549細(xì)胞凋亡率升高
    3.4 討論
第四章 金黃色葡萄球菌PVL誘導(dǎo)THP-1 細(xì)胞自噬、凋亡和焦亡機(jī)制研究
    4.1 實(shí)驗(yàn)材料和試劑
        4.1.1 實(shí)驗(yàn)材料
            4.1.1.1 菌株和細(xì)胞
            4.1.1.2 試劑
        4.1.2 試劑配方
        4.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器
        4.1.4 引物序列
    4.2 實(shí)驗(yàn)方法
        4.2.1 TLR-2、TLR-4 基因,NLRP3 炎癥小體相關(guān)基因以及炎癥因子相關(guān)基因檢測
        4.2.2 NF-κB信號通路活化
        4.2.3 PI3K/AKT/m-TOR信號通路的活化
        4.2.4 NLRP3炎癥小體相關(guān)蛋白的活化
        4.2.5 檢測THP-1細(xì)胞活性氧表達(dá)
        4.2.6 siRNA法抑制THP-1 細(xì)胞NLRP3 表達(dá)
        4.2.7 Western blotting法檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞NLRP3、GSDMD、Caspase-1、Beclin-1、LC3和Caspase-3和Cleaved Caspase-3 表達(dá)
    4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        4.3.1 MRSA菌誘導(dǎo)THP-1 細(xì)胞多種細(xì)胞因子表達(dá)量升高
        4.3.2 NLRP3炎癥復(fù)合體相關(guān)基因的表達(dá)量升高
        4.3.3 THP-1 細(xì)胞TLR-2和TLR-4 基因表達(dá)量升高
        4.3.4 NF-κB信號通路的活化
        4.3.5 THP-1 細(xì)胞PI3K/Akt/m-TOR信號通路的活化
        4.3.6 Western blotting法檢測THP-1 細(xì)胞NLRP3 炎癥復(fù)合體相關(guān)蛋白表達(dá)
        4.3.7 THP-1 細(xì)胞ROS表達(dá)量升高
        4.3.8 轉(zhuǎn)染siRNA-NLRP3后THP-1 細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)變化
    4.4 討論
第五章 金黃色葡萄球菌PVL誘導(dǎo)A549細(xì)胞自噬、凋亡和程序性壞死的研究
    5.1 實(shí)驗(yàn)材料和試劑
        5.1.1 實(shí)驗(yàn)材料
            5.1.1.1 菌株和細(xì)胞
            5.1.1.2 試劑
        5.1.2 試劑配方
        5.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器
    5.2 實(shí)驗(yàn)方法
        5.2.1 細(xì)胞-細(xì)菌共培養(yǎng)
        5.2.2 檢測A549細(xì)胞活性氧的表達(dá)
    5.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        5.3.1 A549細(xì)胞ROS表達(dá)升高
    5.4 討論
第六章 總結(jié)與思考
    6.1 實(shí)驗(yàn)總結(jié)
    6.2 思考與展望
參考文獻(xiàn)
致謝
在學(xué)期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文及其他科研成果


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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本文編號：3154492