促分裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase,MAPK）普遍存在于包括酵母、植物、哺乳動(dòng)物等在內(nèi)的真核生物中,在進(jìn)化過(guò)程中高度保守,已明確的功能包括細(xì)胞分裂、細(xì)胞分化、生物與非生物脅迫應(yīng)答、激素應(yīng)答等,涉及生物生長(zhǎng)發(fā)育的全過(guò)程。實(shí)驗(yàn)室前期從日本晴水稻根組織中克隆了水稻MAPK基因OsMPK15的cDNA編碼區(qū),并發(fā)現(xiàn)OsMPK15基因在水稻多種組織中呈現(xiàn)差異表達(dá)特征,其中在葉和葉鞘中表達(dá)量最高。該基因?qū)Νh(huán)境脅迫信號(hào)和激素信號(hào)均有響應(yīng),其中對(duì)干旱和ABA最為敏感。提示該基因可能涉及水稻葉片的相關(guān)功能,極有可能還參與水稻非生物脅迫應(yīng)答過(guò)程。為鑒定OsMPK15基因的功能,本文采用CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)構(gòu)建OsMPK15基因敲除水稻,旨在進(jìn)一步研究該基因在水稻生長(zhǎng)發(fā)育中的作用。采用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建了OsMPK15基因敲除載體,通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化日本晴水稻愈傷組織,經(jīng)篩選獲得3個(gè)純合轉(zhuǎn)基因株系,分別命名為mpk15-1、mpk15-7、mpk15-8。靶位點(diǎn)特異性分析顯示,3個(gè)株系均未發(fā)生脫靶效應(yīng)。觀察比較mpk15-... 

【文章來(lái)源】：河南師范大學(xué)河南省

【文章頁(yè)數(shù)】：79 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

CRISPR/Cas系統(tǒng)作用的3個(gè)階段（引自MakarovaKS，2011）

Cas9 包含兩個(gè)瓣葉結(jié)構(gòu)，分別為識(shí)別瓣葉和核酸酶瓣葉[13]。識(shí)別瓣葉 gRNA：DNA 復(fù)合體的識(shí)別與結(jié)合，核酸酶瓣葉負(fù)責(zé)切割 DNA 雙鏈。核酸酶瓣葉包含 HNH 和 RuvC 兩個(gè)核酸結(jié)構(gòu)域[14]，用來(lái)切割和降解傳元件。NHN 切割與 sgRNA 互補(bǔ)結(jié)合的 DNA 單鏈，RuvC 切割另一，這兩個(gè)核酸結(jié)構(gòu)域各司其職，對(duì)入侵的外源遺傳元件進(jìn)行切割或降通過(guò)靶序列 20 個(gè)核苷酸的簡(jiǎn)單改造，Cas9 可重新編輯以靶向切割任何，靶向序列通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)引導(dǎo)至靶基因位點(diǎn)，需要注意的是，所選因位點(diǎn)后必須緊接著 5'-NGG-3（'protospacer-adjacent motif, PAM）位點(diǎn)對(duì)于化膿性鏈球菌 Cas9（Streptococcus pyogenes Cas9，SpCas9）的活性少的。將 crRNA 與 tracrRNA 融合，在 5'末端插入 20bp 的靶序列（間隔 sgRNA[15,16]。sgRNA 的改造使 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)最大限度地簡(jiǎn)化為兩Cas9 蛋白和 sgRNA，從而創(chuàng)建了一個(gè)簡(jiǎn)單、高效的基因組工程工具。

配酶切割法法利用的是一類(lèi)特殊的 DNA 酶，它們能夠在單個(gè)或多個(gè)核苷酸形行切割，包括 T7 endonuclease I, T7EI、Surveyor 核酸酶、Cruise酶在錯(cuò)配堿基位點(diǎn)上的活性顯著高于正確互補(bǔ)配對(duì)的堿基位點(diǎn)。因首先是 PCR 擴(kuò)增靶序列，然后待檢測(cè) DNA 擴(kuò)增產(chǎn)物與野生型 D合，高溫變性后，退火形成 DNA 雜交雙鏈，進(jìn)而采用 EMC 法檢糖凝膠電泳圖中條帶數(shù)目和片段大小來(lái)判斷靶序列上是否存在 1-3）。與 PCR/RE 法相比 EMC 法適用于任何靶序列，使用更為也可以在一定程度上切割非錯(cuò)配的同源雙鏈 DNA[65,66]，所以檢測(cè)CR / RE 法，同時(shí)也比較耗時(shí)費(fèi)力[9,60]。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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