本文關(guān)鍵詞：蘇云金芽胞桿菌HD12菌株中cry基因的表達(dá)調(diào)控，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis,簡(jiǎn)稱(chēng)Bt)是一種廣泛分布于自然界的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌。其在形成芽胞的同時(shí)會(huì)產(chǎn)生由殺蟲(chóng)蛋白組成的伴胞晶體,主要由cry和cyt基因編碼。在目前的應(yīng)用中,Bt菌劑存在著毒力有限、殺蟲(chóng)譜較專(zhuān)一、害蟲(chóng)容易產(chǎn)生抗性等問(wèn)題。在遺傳工程菌的構(gòu)建過(guò)程中,多種殺蟲(chóng)基因的協(xié)同表達(dá)十分重要。本實(shí)驗(yàn)室B.thuringiensis subsp.morrisoni strain HD12菌株含有多個(gè)殺蟲(chóng)蛋白,主要對(duì)鱗翅目害蟲(chóng)具有毒性,前期的二代測(cè)序獲得基因組序列,分析其發(fā)現(xiàn)含有8個(gè)cry基因,符合多基因表達(dá)調(diào)控的研究。本研究利用蔗糖梯度離心法純化HD12菌株晶體蛋白,通過(guò)SDS-PAGE和LC-MS/MS對(duì)晶體蛋白進(jìn)行鑒定,確定HD12晶體中含有Cry1Da、Cry1Ae、Cry1Bb、Cry1Fb、Cry1Ja五個(gè)蛋白。同時(shí)通過(guò)在不同遺傳背景的菌株中檢測(cè)cry1Da、cry1Ae、cry1Bb、cry1Fb、cry1Ja啟動(dòng)子的β-半乳糖苷酶活性,確定cry1Da基因的轉(zhuǎn)錄是受SigE控制,其它的四個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄是受SigE、SigK控制。其中cry1Ja和cry1Fb基因啟動(dòng)子活性是最高的。選取cry1Ja和cry1Fb基因啟動(dòng)子來(lái)分別指導(dǎo)Cry1Ac和Cry2Ab蛋白表達(dá)。通過(guò)SDS-PAGE分析和質(zhì)譜鑒定確定cry1Ja、cry1Fb基因啟動(dòng)子均可指導(dǎo)Cry1Ac、Cry2Ab蛋白正確表達(dá)。成功構(gòu)建了具有相同轉(zhuǎn)錄機(jī)制的兩個(gè)不同的啟動(dòng)子指導(dǎo)多個(gè)外源cry基因的表達(dá)菌株。本研究確定了相同轉(zhuǎn)錄機(jī)制的啟動(dòng)子能夠直接指導(dǎo)不同的cry基因在一個(gè)菌株中表達(dá)。這對(duì)克服當(dāng)前Bt殺蟲(chóng)劑應(yīng)用限制,構(gòu)建多基因表達(dá)的菌株具有重要價(jià)值。為Bt菌株中表達(dá)多種依賴(lài)相同調(diào)控機(jī)制的cry基因提供了新思路。
【關(guān)鍵詞】：蘇云金芽胞桿菌 cry基因 cry基因啟動(dòng)子 表達(dá)菌株
【學(xué)位授予單位】：黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：Q78
【目錄】：

• 摘要4-5
• Abstract5-7
• 英文縮略表7-10
• 第一章 文獻(xiàn)綜述10-18
• 1.1 蘇云金芽胞桿菌簡(jiǎn)介10
• 1.2 蘇云金芽胞桿菌殺蟲(chóng)晶體蛋白及其形成過(guò)程10-11
• 1.3 cry基因的表達(dá)調(diào)控11-15
• 1.3.1 轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控11-13
• 1.3.2 轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控13-15
• 1.3.3 翻譯水平15
• 1.4 Cry蛋白的增效15-16
• 1.5 高效啟動(dòng)子在工程菌構(gòu)建中的應(yīng)用16-17
• 1.6 研究目的與意義17-18
• 第二章 HD12菌株生物信息學(xué)分析及晶體蛋白純化18-22
• 2.1 材料與方法18-20
• 2.1.1 供試菌株18
• 2.1.2 主要試劑和儀器18-19
• 2.1.3 培養(yǎng)基19
• 2.1.4 試驗(yàn)方法19-20
• 2.2 結(jié)果與分析20-21
• 2.3 小結(jié)21-22
• 第三章 HD12菌株cry基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制分析22-56
• 3.1 材料與方法22-33
• 3.1.1 供試菌株和質(zhì)粒22-23
• 3.1.2 主要試劑和儀器23-25
• 3.1.3 培養(yǎng)基25
• 3.1.4 引物序列25-26
• 3.1.5 試驗(yàn)方法26-33
• 3.2 結(jié)果與分析33-53
• 3.2.1 cry1Da基因轉(zhuǎn)錄機(jī)制分析33-36
• 3.2.2 cry1Ae基因轉(zhuǎn)錄機(jī)制分析36-39
• 3.2.3 cry1Bb基因轉(zhuǎn)錄機(jī)制分析39-43
• 3.2.4 cry1Fb基因轉(zhuǎn)錄機(jī)制分析43-46
• 3.2.5 cry1Ja基因轉(zhuǎn)錄機(jī)制分析46-49
• 3.2.6 cry基因啟動(dòng)子序列及活性比對(duì)分析49-53
• 3.3 小結(jié)53-56
• 第四章 HD12菌株強(qiáng)啟動(dòng)子啟動(dòng)異源基因表達(dá)56-68
• 4.1 材料與方法56-59
• 4.1.1 供試菌株和質(zhì)粒56-57
• 4.1.2 主要試劑和儀器57
• 4.1.3 培養(yǎng)基57
• 4.1.4 引物序列57-58
• 4.1.5 試驗(yàn)方法58-59
• 4.2 結(jié)果與分析59-65
• 4.2.1 pHT315-P1Ja-1Ac與pHT315-P1Fb-1Ac表達(dá)載體的構(gòu)建59-60
• 4.2.2 pHT1618-P1Ja-2Ab與pHT1618-P1Fb-2Ab表達(dá)載體的構(gòu)建60-62
• 4.2.3 cry1Ja、cry1Fb基因啟動(dòng)子啟動(dòng)Cry1Ac、Cry2Ab表達(dá)的重組菌株構(gòu)建62
• 4.2.4 cry1Ja、cry1Fb基因啟動(dòng)子啟動(dòng)Cry1Ac、Cry2Ab蛋白表達(dá)分析62-63
• 4.2.5 cry1Ja、cry1Fb基因啟動(dòng)子啟動(dòng)Cry1Ac、Cry2Ab蛋白表達(dá)菌株質(zhì)譜鑒定63-65
• 4.3 小結(jié)65-68
• 第五章 討論與結(jié)論68-72
• 5.1 討論68-69
• 5.1.1 HD12菌株中cry基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制分析68
• 5.1.2 不同啟動(dòng)子啟動(dòng)Cry1Ac、Cry2Ab蛋白表達(dá)產(chǎn)量分析68-69
• 5.2 結(jié)論69-72
• 參考文獻(xiàn)72-80
• 致謝80-82
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷82

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前8條

1 彭琦;周子珊;張杰;;蘇云金芽胞桿菌殺蟲(chóng)晶體蛋白研究進(jìn)展[J];中國(guó)生物防治學(xué)報(bào);2015年05期

2 鄭慶云;王冠男;張U

本文編號(hào)：313127