目的建立肝特異性G6PC基因純合缺陷的Ia型糖原累積癥（glycogen storage disease Ia, GSD Ia）小鼠模型。方法通過CRISPR/Cas9基因重組技術(shù)使C57BL/6J小鼠受精卵中G6PC基因外顯子2兩側(cè)分別插入1個(gè)loxP原件,產(chǎn)仔后經(jīng)鑒定打靶成功的小鼠通過擴(kuò)繁、兄妹交配及與Alb-Cre小鼠交配,最終產(chǎn)生G6PC-loxP^+/+、Alb-Cre共表達(dá)的肝特異性G6PC基因2號外顯子純合敲除的GSD Ia小鼠模型。通過監(jiān)測模型鼠及背景鼠的餐后0～12 h的血糖來驗(yàn)證模型是否成功。結(jié)果經(jīng)PCR鑒定F0及F1代小鼠成功于G6PC基因2號外顯子兩側(cè)插入loxP原件并可穩(wěn)定遺傳;最終成功建立G6PC-loxP^+/+、Alb-Cre共表達(dá)的GSD Ia小鼠,檢測餐后1～12 h血糖均低于背景鼠,說明造模成功。結(jié)論應(yīng)用CRISPR/Cas9基因重組技術(shù)及l(fā)oxP-Cre系統(tǒng)可建立肝特異性G6PC基因缺陷的GSD Ia小鼠,可用于該病的病理研究及藥物研發(fā)。 

【文章來源】：北京醫(yī)學(xué). 2020,42(11)

【文章頁數(shù)】：5 頁

【部分圖文】：

中靶載體示意圖

Lei等[3]于1996年報(bào)道了全身型G6PC基因3號外顯子敲除純合缺陷小鼠的制備過程，但該小鼠病情嚴(yán)重，壽命過短，大多數(shù)存活至斷奶，存活超過5周齡的小鼠不足12%，不適于藥物研發(fā)及長期觀察。2009年，Peng等[4]報(bào)道了應(yīng)用胚胎干細(xì)胞DNA同源重組技術(shù)，利用EIIa-Cre-loxP與FLPe-Frt策略制備的G6PC3號外顯子條件無效小鼠模型；可引起腎、肝特異性缺乏G6P，存活時(shí)間可長達(dá)10～20個(gè)月[5]。2010年，Mutel等[6]應(yīng)用ERT2-Cre-loxP系統(tǒng)制備了肝特異性G6PC 3號外顯子條件無效小鼠模型，存活超過18個(gè)月。條件無效小鼠模型存活時(shí)間長，較適于藥物研發(fā)。本研究團(tuán)隊(duì)曾經(jīng)嘗試應(yīng)用文獻(xiàn)中報(bào)道的Cre-loxP策略復(fù)制條件無效小鼠模型，但造模失敗。最終選擇應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)在G6PC基因中插入loxP元件，進(jìn)而通過Alb-Cre-loxP策略制備了肝特異性G6PC 2號外顯子純合敲除的GSD Ia小鼠。圖3 G6Pase LKO小鼠及背景鼠禁食后血糖-時(shí)間監(jiān)測圖

G6Pase LKO小鼠及背景鼠禁食后血糖-時(shí)間監(jiān)測圖


本文編號：3128372