本研究以‘大五星’（紅肉）和“川農(nóng)1-5-9”（白肉）枇杷（Eriobotrya japonica Lindl.）不同發(fā)育階段枇杷果實果皮、果肉為材料,采用同源克隆法獲得類胡蘿卜素積累過程中關(guān)鍵酶基因——PSY和CYCB,并將獲得的核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析,再利用qRT-PCR從轉(zhuǎn)錄水平上檢測兩種枇杷不同發(fā)育階段基因表達(dá)水平。本研究還利用VIGS技術(shù)分別干擾‘早鐘6號’枇杷果實中PSY、CYCB基因的表達(dá),并分析沉默后類胡蘿卜素代謝途徑中相關(guān)基因的表達(dá)情況,探究PSY、CYCB基因在枇杷果實類胡蘿卜素積累過程中的調(diào)控作用。研究結(jié)果如下:1、同源克隆獲得了PSY、CYCB基因cDNA序列全長,分別具有一個1 191 bp和1 491 bp的完整的開放閱讀框,推導(dǎo)出氨基酸396和496個。不同品種（系）間的PSY、CYCB序列比對發(fā)現(xiàn),序列間具有很高的相似性,都僅有1個氨基酸的差異。氨基酸同源性分析表明,枇杷PSY、CYCB蛋白分別與其他物種具有很高的相似性,可能具有相似的生理特征和形態(tài)特征。2、qRT-PCR分析表明,隨著枇杷果實的發(fā)育,PSY、CYCB基因表達(dá)量明... 

【文章來源】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)四川省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：67 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

前體GGPP合成Fig.1ThesynthesisofprecursorGGPPIDIIPPDMAPPGGPPSGGPP

利用改造的煙草花葉病毒（TMV）載體將本氏煙 PDS 基因沉默[17]。而后基于 TMV載體已開發(fā)出多種 VIGS 載體，除 PVX[104]、TGMV[105]等較早開發(fā)的載體外，近年來針對不同宿主陸續(xù)開發(fā)了多種載體。RNA病毒載體應(yīng)用最為廣泛，常用的主要有TMVPVX 和 TRV 等。早期開發(fā)的 TMV、PVX 和 TGMV 載體引起寄主植物表型疊加，且不能侵染生長點。TRV 載體克服了 TMV、PVX、TGMV 載體的缺點，具有能夠侵染分生組織，寄主范圍廣，沉默效率高，持續(xù)時間長，對寄主傷害小且沉默表型明顯等優(yōu)點[11, 13, 18]。TRV 載體為雙分體單鏈正義 RNA（圖 3），RNA1（pTRV1）和 RNA2（pTRV2）cDNA克隆都從載體兩個花椰菜 35S 啟動子（2×CaMV 35S）到 NOS 終止子，LB 和 RB 為載體的左邊界和右邊界，Rz 為 pTRV1 和 pTRV2 共享的自切割核酶。pTRV1 還包含RNA 依賴的 RNA 聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRp）、移動蛋白（movement protein，MP）和一個 16 kDa 富集半胱氨酸的蛋白[13]。pTRV2 還包含外殼蛋白（coat protein，CP）和一個多克隆位點（multiple cloning site，MCS）[13]。

14圖 6 離體枇杷材料示意圖Fig. 6 In-vitro loquat fruit at breaker stage和BamH I核酸內(nèi)切酶、T4連接酶、Rax DNA Polymerase）、RR047A型2×TaqPCRMasterMix、B518191型質(zhì)卡那霉素（Kan）、利福平（Rif）、慶各種培養(yǎng)試劑于上海生工購置。DP天根購置。和 GV3101）于北京博邁德購置。p

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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[3]VIGS誘導(dǎo)MdHB-1沉默對蘋果果實成熟的影響[J]. 溫小紅,姜永華,周軻,任小林.  西北農(nóng)業(yè)學(xué)報. 2015(11)
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[7]SEPALLATA（SEP）1/2-like轉(zhuǎn)錄因子MdMADS9在早生富士蘋果果實β-胡蘿卜素合成中的作用[J]. 何曉文,王永章,劉成連,原永兵.  青島農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版). 2013(04)
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博士論文
[1]面粉顏色相關(guān)性狀分子基礎(chǔ)及關(guān)鍵基因Psy1功能研究[D]. 翟勝男.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 2016
[2]紅肉和白肉枇杷果實類胡蘿卜素差異積累機(jī)制研究[D]. 傅秀敏.浙江大學(xué) 2013

碩士論文
[1]正向遺傳學(xué)研究中的候選基因識別[D]. 王緯韜.浙江大學(xué) 2017
[2]歐李果實花色苷生物合成相關(guān)結(jié)構(gòu)基因克隆與表達(dá)分析[D]. 楊淑一.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 2015
[3]利用VIGS技術(shù)對草莓FaMYB5基因功能的研究[D]. 王玲.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 2015
[4]胡蘿卜PSY基因的功能研究[D]. 王慧.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 2014
[5]紅肉臍橙和普通臍橙果實類胡蘿卜素合成基因的差異表達(dá)[D]. 金蓉.浙江大學(xué) 2007



本文編號：3124773