發(fā)布時(shí)間：2021-04-06 13:52

　　Lunasin,是從大豆中分離獲得的新型天然多肽,分子量為5.0 KD左右,含有44個(gè)氨基酸;具有多種功能活性,應(yīng)用前景廣闊。但天然來(lái)源的Lunasin多肽含量極低,化學(xué)合成成本較高,如何高效獲得Lunasin多肽是需要攻克的難題。隨著分子生物學(xué)與基因工程的發(fā)展,利用DNA重組技術(shù)高效合成Lunasin多肽使這一設(shè)想成為可能。轉(zhuǎn)基因大豆是目前世界上種植范圍最廣泛的遺傳修飾農(nóng)作物,通過(guò)基因工程技術(shù)獲取優(yōu)良轉(zhuǎn)基因大豆的手段日趨成熟。本研究利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆遺傳轉(zhuǎn)化,將大豆內(nèi)源基因Lunasin多肽編碼基因轉(zhuǎn)入其基因組中,由35S強(qiáng)啟動(dòng)子啟動(dòng)基因過(guò)量表達(dá),篩選高Lunasin含量的轉(zhuǎn)基因大豆株系,建立轉(zhuǎn)基因大豆功能活性評(píng)價(jià)體系,結(jié)合轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組學(xué)分析揭示Lunasin多肽抗癌分子機(jī)制。取得以下實(shí)驗(yàn)進(jìn)展:1.轉(zhuǎn)基因大豆的獲得:采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化將Lunasin多肽編碼基因轉(zhuǎn)入大豆基因組中,目前已獲得15個(gè)獨(dú)立的T1代轉(zhuǎn)基因大豆株系。建立了Lunasin多肽高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用分析方法,Lunasin多肽在保留時(shí)間10.606 min時(shí)出峰,其一級(jí)質(zhì)譜分析可檢測(cè)到多個(gè)母離子信號(hào),... 

【文章來(lái)源】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京市

【文章頁(yè)數(shù)】：89 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【部分圖文】：

Lunasin多肽的一級(jí)結(jié)構(gòu)序列及功能示意圖(Hernándezledesmaetal.,2009)

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文第一章引言10化能力；選用脂多糖LPS誘發(fā)的小鼠巨噬細(xì)胞RAW26.7炎癥反應(yīng)為試驗(yàn)?zāi)Ｐ停瑱z測(cè)Lunasin多肽富集物對(duì)炎癥反應(yīng)的抑制能力。人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231是廣泛應(yīng)用于癌癥機(jī)理研究、靶標(biāo)信號(hào)傳導(dǎo)和功能營(yíng)養(yǎng)等方面的一類細(xì)胞株，因此可通過(guò)分析Lunasin多肽富集物對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞增值的抑制情況來(lái)評(píng)估其抗癌活性。通過(guò)細(xì)胞免疫熒光染色對(duì)Lunasin多肽進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析，了解Lunasin多肽在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮功能時(shí)的具體部位。3.選用人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231模型，綜合應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組測(cè)序技術(shù)，全面分析Lunasin處理前后細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)調(diào)控，分析蛋白間的相互作用，篩選差異基因、差異蛋白，進(jìn)行GO/KEGG富集分析，挖掘其抗癌核心調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。1.8.2技術(shù)路線圖1-2實(shí)驗(yàn)技術(shù)路線示意圖Fig.1-2Schematicdiagramofexperimentaltechnicalroute

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文第二章Lunasin過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因大豆的獲得及其分子生物學(xué)分析1680%B，23min80%B，24min5%B，30min5%B。質(zhì)譜型號(hào)為飛行時(shí)間質(zhì)譜（TripleTOF6600），離子源為電噴霧離子源（ESI源），采用IDA模式對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，樣品經(jīng)離子化后進(jìn)行TOF-MS一級(jí)掃描（掃描范圍為200-2000Da）和TOF-MS/MS子離子掃描（掃描范圍為50-2000Da）。離子源溫度為550℃，霧化氣Gas1為50psi，以氮?dú)庾鳛檩o助加熱氣Gas2（50psi），氣簾氣為35psi，離子采集模式為正離子模式。2.3結(jié)果與分析2.3.1轉(zhuǎn)基因大豆的獲得通過(guò)對(duì)大豆愈傷組織的抗性篩選及PCR鑒定，我們獲得了15個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因大豆株系。如圖2-1所示為大豆遺傳轉(zhuǎn)化載體構(gòu)建示意圖，Lunasin編碼基因由35S強(qiáng)啟動(dòng)子啟動(dòng)表達(dá)；另外，在農(nóng)桿菌T-DNA區(qū)域含有草甘膦抗性篩選（EPSPS），由Tsf啟動(dòng)子控制表達(dá)，便于轉(zhuǎn)基因材料的初步確定。圖2-2所示為大豆遺傳轉(zhuǎn)化詳細(xì)過(guò)程：(a)挑選顆粒飽滿的大豆種子進(jìn)行萌發(fā)試驗(yàn)；(b)農(nóng)桿菌侵染；(c)農(nóng)桿菌與下胚軸共培養(yǎng)；(d)愈傷組織的抗性篩眩(e)胚性抗性愈傷誘導(dǎo)過(guò)程，誘導(dǎo)其分化，生根、發(fā)芽。(f)植株再生，獲得轉(zhuǎn)基因大豆。圖2-1載體構(gòu)建示意圖Fig.2-1Vectorconstruction圖2-2大豆遺傳轉(zhuǎn)化Fig.2-2Genetictransformationofsoybean圖2-2（a）大豆萌發(fā)，獲取大豆下胚軸；2-2（b）農(nóng)桿菌侵染外植體；（c）農(nóng)桿菌與下胚軸共培養(yǎng)；（d）愈傷組織抗性篩選；（e）胚性抗性愈傷誘導(dǎo)分化；（f）植株再生。2-2(a)Soybeanseedswereselectedtogerminatefortheexplants.(b)Agrobacteriuminfection.(c)Co-cultureofexplantsandagrobacteria.(d)Resistancescreeningofcallus.(e)Inductiondifferentiationofthecallus.(f)Plantletregeneration.

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