中介體（Mediator Complex）是廣泛存在于動物、植物和微生物中的一類多蛋白復(fù)合物,其空間構(gòu)象由頭部、中部、尾部和激酶模塊構(gòu)成,在真核生物的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵的橋梁作用。對植物中介體的研究多集中在擬南芥,比如控制胚胎的形成、芽分生組織的發(fā)育、影響開花時間、根毛生成等。此外,它還參與非生物脅迫的響應(yīng)。番茄作為一種廣泛種植的蔬菜作物,具有重要的經(jīng)濟價值。而且,它還是用于科學(xué)研究的模式植物。然而,干旱、高鹽等不良環(huán)境對番茄的生長和產(chǎn)量造成極大的損害。目前對番茄中介體參與非生物脅迫響應(yīng)的研究知之甚少,所以,對番茄抗性基因的深入探究顯得至關(guān)重要。本研究利用生物信息學(xué)方法從番茄中篩選出SlMed23基因,構(gòu)建沉默載體,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化至番茄,通過RNA干擾技術(shù)沉默該基因的表達(dá)。此后,通過qRT-PCR技術(shù)探究SlMed23在番茄各個生長發(fā)育時期的表達(dá)水平,并檢測其相關(guān)發(fā)育時期的生理生化指標(biāo),以期對SlMed23基因參與番茄生長發(fā)育的調(diào)控和在非生物脅迫中的功能進(jìn)行初步的探究。主要研究內(nèi)容如下所示:（1）由生物進(jìn)化樹分析可得,番茄SlMed23基因和擬南芥AtMed23具有較... 

【文章來源】：重慶大學(xué)重慶市 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

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SlMED23與擬南芥中介體氨基酸序列間的進(jìn)化關(guān)系

2SlMed23基因的生物信息學(xué)分析15如圖2.2所示。圖2.2SlMED23與其他物種中介體MED23氨基酸序列間的進(jìn)化關(guān)系。Bd：B.distachyon，二穗短柄草；Zm：Z.mays，玉米；Sb：S.bicolor，高粱；Os：O.sativa，水稻；Sem：S.moellendorffii，卷柏；At：A.thaliana，擬南芥；Sl：S.lycopersicum，番茄。Figure2.2EvolutionaryrelationshipbetweenaminoacidsequencesofSlMED23andMED23ofotherspecies.通過進(jìn)化樹可以看出，AtMED23與SlMED23氨基酸序列最為同源，聚為一類，而與SemMED23較遠(yuǎn)，同源性較低。在擬南芥中，Dolan等[73]發(fā)現(xiàn)，Atmed5b突變體植株生長矮小，苯丙素的生物積累受到抑制，如果在這個突變體中抑制AtMed23的表達(dá)，則可將Atmed5b突變體恢復(fù)至野生型狀態(tài)。由此可見，AtMed23在苯丙素的生物合成中發(fā)揮著重要的作用。而AtMED23與SlMED23氨基酸序列有著較高的相似性，這暗示了SlMed23可能具有和擬南芥AtMed23類似的生物學(xué)功能。2.2.3SlMED23與AtMED23蛋白的序列比對分析為了進(jìn)一步明確SlMED23和AtMED23蛋白質(zhì)序列間的相似程度，對它們進(jìn)行了蛋白質(zhì)序列比對分析，如圖2.2所示。

3SlMed23基因的表達(dá)模式23SlEF1α：F：5’-TACTGGTGGTTTTGAAGCTG-3’R：5’-AACTTCCTTCACGATTTCATCATA-3’②qRT-PCR反應(yīng)的最適溫度目標(biāo)引物的PCR反應(yīng)受退火溫度的影響，因此探究引物的最適溫度尤為重要。本研究使用的qRT-PCR儀器由美國Bio-rad公司生產(chǎn)，將不同的試劑加入與定量PCR儀相匹配的qRT-PCR管中，然后采用兩步法反應(yīng)程序?qū)ふ襍lMed23引物的最適溫度。反應(yīng)體系：試劑體積2×GoTaqqPCRMasterMix5.0μLqSlMed23（F+R）0.5μL模板1.5μL水（Promega）3.0μL總計10.0μL反應(yīng)程序：圖3.1兩步法反應(yīng)程序Figure3.1Two-stepReactionProcedure反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)結(jié)果選擇峰值最高的溶解曲線，找到對應(yīng)的溫度即為SlMed23的最適溫度，實驗結(jié)果顯示目標(biāo)引物的最適溫度是62.3°C。③標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線可以用來檢測qRT-PCR的條件是否達(dá)到最優(yōu)，可以將反轉(zhuǎn)錄的模板cDNA進(jìn)行一系列的稀釋（1倍、10倍、100倍、1000倍、10000倍等），然后分析反應(yīng)結(jié)果，將其制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，經(jīng)分析，定量引物滿足要求，因此，可用該引物檢測SlMed23在番茄不同組織以及在不同脅迫和激素處理下的表達(dá)水平，

【參考文獻(xiàn)】：
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博士論文
[1]番茄SlNAC4和SlDEAD31基因在果實成熟及非生物脅迫響應(yīng)中的功能研究[D]. 朱明庫.重慶大學(xué) 2015
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碩士論文
[1]高溫誘導(dǎo)番茄柱頭外露的生理及分子基礎(chǔ)的研究[D]. 王燕.浙江大學(xué) 2015
[2]番茄滯綠基因LeSGR1的克隆和功能研究[D]. 嚴(yán)波.重慶大學(xué) 2007



本文編號：3102876