【目的】克隆綿羊真核翻譯起始因子eI F3h,構(gòu)建原核表達載體,并誘導(dǎo)外源蛋白表達,檢測、鑒定帶有His標簽的目的蛋白�！痉椒ā扛鶕�(jù)Genbank中綿羊eI F3h基因CDS序列設(shè)計引物,PCR特異擴增DNA片段,酶切、連接至pE T28α（+）載體,將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌E.coli BL21（DE3）株中誘導(dǎo)eI F3h蛋白表達。采用SDS-PAGE電泳分析目的蛋白表達情況,利用Western blot技術(shù)檢測、鑒定目的蛋白。【結(jié)果】正確、完整的克隆到綿羊eI F3h基因CDS區(qū)序列,片段全長1 059 bp。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌E.coli BL21（DE3）株后,在37℃,1 mmol/L濃度的IPTG誘導(dǎo)3.5 h后獲得以包涵體形式存在的目的蛋白,分子量大小約為40 kD�！窘Y(jié)論】獲得了完整、正解的綿羊eI F3h基因CDS區(qū)序列片段,構(gòu)建了該基因的原核表達載體,成功誘導(dǎo)了綿羊eI F3h基因外源表達的目的蛋白,為綿羊eI F3h基因的后續(xù)研究提供了科學數(shù)據(jù)。 

【文章來源】：新疆農(nóng)業(yè)科學. 2017,54(02)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：7 頁

【部分圖文】：

重組表達質(zhì)粒eIE3h－pET28α(+)

2期于常江等:綿羊eIF3h基因克壟原核表達及蛋白鑒定注:M為marker;1～2為eIE3h－pET28α(+)載體雙酶切;3為eIE3h－pET28α(+);4為陰性對照Note:M，marker;1－2:DigestionproductsofeIE3h－pET28α(+)expressionvector;3，eIE3h－pET28α(+)expressionvector;4，Negativecontrol圖3eIE3h－pET28α(+)質(zhì)粒酶切Fig．3DigestionresultsofeIE3h－pET28α(+)expressionvector將重組質(zhì)粒用EcoＲI、HindIII進行雙酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，得到大小約1000～1500bp范圍內(nèi)的片段。測序結(jié)果說明，重組質(zhì)粒中插入的片段與Genbank中基因序列完全相同，原核表達載體構(gòu)建成功。圖3，圖42．4eIF3h重組蛋白表達形式的鑒定篩癬鑒定出轉(zhuǎn)化至E．coliBL21的陽性菌株，接種于含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中。37℃過夜培養(yǎng)，以1∶100的稀釋比例，將培養(yǎng)物重新接種于新培養(yǎng)基，培養(yǎng)物OD值達到0.6時，加入IPTG誘導(dǎo)3.5h。分別收集誘導(dǎo)培養(yǎng)物的上清和沉淀，SDS－PAGE電泳檢測分析:外源誘導(dǎo)表達的重組蛋白以包涵體形式存在于沉淀(圖5、圖6分別表示誘導(dǎo)的重組蛋白可溶及不溶部分)，上清未檢測到重組表達的目的蛋白;在一定濃度范圍內(nèi)，蛋白量隨IPTG濃度的增加而增加，與此同時蛋白量也隨著誘導(dǎo)時間的延長而增多。圖5，圖6圖4eIE3h基因序列部分測序圖譜Fig．4ThesequencingmapofeIE3h2．5eIE3h重組蛋白的鑒定誘導(dǎo)后的大腸桿菌裂解后，對該沉淀包涵體蛋白進行Westernblot檢測，查看所表達的蛋白是否為目的蛋白。結(jié)果顯示:在37℃條件下，經(jīng)0.8mmol/LIPTG誘導(dǎo)3.5h后收集的蛋白產(chǎn)物與抗體發(fā)生較明顯的免疫反應(yīng)，條帶大小約為40kD(蛋白Marker未顯示)，表明目的蛋白得到表達，該基因原核表達成功。圖7389

行災(zāi)什晃榷ǎ??鞠凳??9.20，總平均親水指數(shù)為－0.561;對該基因信號肽、疏水性及跨膜結(jié)構(gòu)的分析發(fā)現(xiàn)，無信號肽，無跨膜結(jié)構(gòu)(TMHMMServerv.2.0)，疏水性最大值為3.22，最小值為－3.83;抗原位點具有15個，推測具有較好的免疫原性。2．3eIE3h－pET28α(+)原核重組表達載體的構(gòu)建用EcoＲI、HindIII分別雙酶切純化后的PCＲ產(chǎn)物片段及pET28α(+)質(zhì)粒，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠純化后，再通過連接、轉(zhuǎn)化，篩選重組子，使eIF3h基因CDS區(qū)段連接入pET28α(+)載體，并將重組載體命名為eIE3h－pET28α(+)，繪出結(jié)構(gòu)示意。圖2圖2重組表達質(zhì)粒eIE3h－pET28α(+)Fig．2ConstructionoftheeIE3h－pET28α(+)expressedplasmid388

【參考文獻】：
碩士論文
[1]EIF3h蛋白表達及其基因多態(tài)性與結(jié)直腸癌相關(guān)性研究[D]. 吳繼華.第三軍醫(yī)大學 2013



本文編號：3092073