發(fā)布時間：2021-03-21 01:26

　　大菱鲆是我國重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖經(jīng)濟魚類,由于蛋白含量高、脂肪含量低及味道鮮美等優(yōu)點受到消費者青睞。然而其在貯藏過程中極易發(fā)生腐敗變質(zhì),導(dǎo)致食用品質(zhì)及經(jīng)濟價值大大降低。研究發(fā)現(xiàn),微生物的生長代謝是導(dǎo)致水產(chǎn)品腐敗變質(zhì)的主要原因,而群體感應(yīng)（Quorum sensing,QS）系統(tǒng)作為細菌間信息交流方式能夠調(diào)節(jié)微生物的腐敗表型�；诟蓴_QS系統(tǒng)策略,利用群體感應(yīng)抑制劑（Quorum Sensing Inhibitors,QSIs）抑制水產(chǎn)品腐敗微生物的致腐特性,為水產(chǎn)品保鮮提供了新途徑。但是尋找QSIs的傳統(tǒng)方法是隨機的、耗時的、低效的,且一些已報道的QSIs抑制機理尚不明確。因此,本文以大菱鲆源溫和氣單胞菌（Aeromonas sobria）群體感應(yīng)調(diào)控基因luxI/R為研究對象,通過同源建模、虛擬篩選、分子對接等方法更加高效地尋找具有潛力的新型QSIs,并對QSIs的抑制效果及機理進行探究,旨在深層次探究水產(chǎn)品腐敗菌的QS機制及QSI鄰氨基苯甲酸甲酯的抑制機理,為建立靶向控制QS系統(tǒng)為基礎(chǔ)的水產(chǎn)品保鮮新技術(shù)提供實驗依據(jù)。主要結(jié)論如下:1.利用分子生物學方法篩選與驗證溫和氣單胞菌中QS調(diào)控基因... 

【文章來源】：渤海大學遼寧省

【文章頁數(shù)】：77 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

革蘭氏陰性菌LuxI/LuxR型系統(tǒng)

渤海大學碩士學位論文3子經(jīng)寡肽通透酶系統(tǒng)（Opp）內(nèi)化到細胞中，從而與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，形成的復(fù)合物可以調(diào)節(jié)毒力因子的分泌[16]。此外，枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）中也存在AIP介導(dǎo)的QS系統(tǒng)，以phrC編碼的五肽CSF為信號分子。當達到一定濃度閾值時，CSF與組氨酸激酶ComP結(jié)合，從而激活轉(zhuǎn)錄因子，促進生物孢子形成[17]。圖1-2金黃色葡萄球菌Agr型QS系統(tǒng)Fig.1-2AgrQSsysteminStaphylococcusaureus1.1.3細菌種間QS系統(tǒng)自誘導(dǎo)劑-2（Autoinducer-2,AI-2）信號分子是一種呋喃基硼酸二酯類化合物，通常以SAM為底物經(jīng)S-核糖高半胱氨酸裂解酶（S-ribosylhomocysteinelyase,LuxS）催化而合成。LuxS/AI-2型QS系統(tǒng)是由AI-2信號分子介導(dǎo)的用于種屬間信息交流的一種方式，廣泛存在于革蘭氏陽性菌與革蘭氏陰性菌之間[18]。細菌通過識別AI-2信號分子感應(yīng)環(huán)境中其它細菌的濃度來調(diào)節(jié)自身行為，從而在競爭中占有優(yōu)勢。這種現(xiàn)象最初發(fā)現(xiàn)于哈維氏弧菌（Vibrioharveryi）誘導(dǎo)生物發(fā)光的研究，該菌QS系統(tǒng)不僅可以產(chǎn)生AHLs，還可以產(chǎn)生AI-2信號分子[19]。當AI-2累積到一定閾值時，與感受因子LuxP結(jié)合，形成的復(fù)合物與傳感器激酶LuxQ結(jié)合，誘導(dǎo)LuxQ轉(zhuǎn)為磷酸酶狀態(tài)，隨后啟動磷酸轉(zhuǎn)移級聯(lián)反應(yīng)，最終激活luxCDABE的轉(zhuǎn)錄并發(fā)出生物熒光。研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)氣芽孢梭菌（Clostridiumperfringens）中外毒素的分泌，彎曲空腸桿菌（Campylobacterjejunmi）的運動性，出血性大腸桿菌（EscherichiacoliO157:H7）的毒素及運動性均受AI-2型QS系統(tǒng)調(diào)控。1.1.4其他QS系統(tǒng)除以上常見的QS系統(tǒng)外，在出血性大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)了由AI-3信號分子介導(dǎo)的QseC/QseB雙組份系統(tǒng)[20]。AI-3具有與腎上腺素和去腎上腺素相類似的結(jié)構(gòu)特征。當達到一定濃度閾值時，AI-3與傳感器激酶QseC結(jié)合，激活反應(yīng)?

大菱鲆源溫和氣單胞菌群體感應(yīng)luxI/luxR基因表達及其抑制劑的研究122.3.6.5信號肽預(yù)測使用SignalP4.1Server工具（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/），選擇NeuralNetworks和HiddenMarkovModels兩種方法進行分析，參數(shù)設(shè)置為默認值。2.3.6.6亞細胞定位預(yù)測通過PSORTb軟件和TaragetP1.1分析工具對LuxI/R蛋白進行亞細胞定位預(yù)測。2.3.6.7蛋白超家族預(yù)測將氨基酸序列提交至NCBI的保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫（ConservedDomainDatabase,https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）進行結(jié)構(gòu)域分析。該數(shù)據(jù)庫包括來源于不同數(shù)據(jù)庫的保守結(jié)構(gòu)域，每個結(jié)構(gòu)域都有各自特有的模型，可以為保守結(jié)構(gòu)域的位置及功能位點提供注釋。2.3.6.8功能位點預(yù)測使用PROSITE分析工具（https://prosite.expasy.org/）進行分析，參數(shù)設(shè)置為默認值。2.3.6.9LuxI/R蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測利用PSIPRED軟件（http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/）進行分析，參數(shù)設(shè)為默認值。2.4結(jié)果與分析2.4.1溫和氣單胞菌群體感應(yīng)調(diào)控基因luxI/luxR的驗證溫和氣單胞菌由本實驗室從腐敗大菱鲆中分離獲得，經(jīng)過16sRNA測序及BLAST比對，發(fā)現(xiàn)其與NCBI數(shù)據(jù)庫中溫和氣單胞菌（AeromonassobriaGX1）的相似性達99%。為了驗證溫和氣單胞菌中是否含有LuxI/R同系物（luxI/luxR），使用設(shè)計的特異性引物進行PCR擴增，并通過瓊脂糖凝膠電泳驗證擴增產(chǎn)物。圖2-1為溫和氣單胞菌luxI/luxR基因瓊脂糖凝膠電泳圖，從圖中可以觀察到在預(yù)期大小處有明亮且單一的條帶，且無引物二聚體出現(xiàn)。圖2-1溫和氣單胞菌luxI/R基因特異性引物PCR擴增產(chǎn)物Fig.2-1ThePCRamplificationproductsofluxI/RspecificprimersofAeromonassobria2.4.2產(chǎn)物測序及序列比對


本文編號：3092045