高抗水稻白葉枯病相關(guān)新基因的克隆及抗病機制研究
發(fā)布時間:2021-03-06 01:50
水稻白葉枯病是由Xanthomonas oryzae pv.oryzae(Xoo)引起的一種毀滅性病害,可造成水稻大量減產(chǎn)?共∑贩N的利用是一種經(jīng)濟且對環(huán)境友好的防治手段,但是其前提是需要不斷挖掘新的抗白葉枯病基因資源并明確抗病基因功能。本研究利用前期誘變獲得的廣譜高抗白葉枯病的水稻類病變突變體hpil3開展了抗病目標基因定位、克隆,蛋白組學(xué),目標基因的互作基因篩選等相關(guān)研究,同時對疣粒野生稻中RCA在抗白葉枯病中的作用機理進行了研究。主要研究成果如下:利用hpil3和其野生型大粒香水稻通過基于重測序的圖位克隆策略成功定位并克隆了該突變體的目標基因。該基因定位在4號染色體的20-22Mb區(qū)域內(nèi),進一步篩選得到7個候選的基因。通過對突變位點的驗證和生物信息學(xué)分析最終確定了一個可能性較大的候選基因。轉(zhuǎn)基因功能互補驗證結(jié)果表明,該野生型基因成功使hpil3的表型恢復(fù)為野生型并喪失了對白葉枯病的抗性,從而確證了該候選基因就是hpil3的目標基因。通過實時熒光定量PCR發(fā)現(xiàn)hpil3中病程相關(guān)基因PR1a、PR1b、PR5、PR10表達量顯著高于其野生型大粒香(DLX),而PR9略高于DLX;未...
【文章來源】:沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)遼寧省
【文章頁數(shù)】:140 頁
【學(xué)位級別】:博士
【部分圖文】:
用基因組重測序的方法定位突變體hpil3目標基因Fig.2.3Genemappingofhpil3throughgenomeresequencing
沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文392.3.3hpil3候選目標基因的克隆和超表達載體的構(gòu)建將提取好的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,用全長引物15M41F/R進行擴增(圖2.4-a)。先將PCR產(chǎn)物凝膠純化回收,先與入門載體pB2E-T連接(圖2.4-b),再將目標片段通過LR反應(yīng)轉(zhuǎn)移至超表達載體pCAMBIA1300-DEST中(圖2.4-c)。圖2.4hpil3候選目標基因的檢測a:目標基因的克隆;b:目標基因連接入門載體pB2E-T的檢測圖片;c:目標基因連接超表達載體pCAMBIA1300-DESTFig.2.4testoncandidategeneofhpil3a:thetestpictureofhpil3tagetgenecloned,b:thetestpictureofhpil3tagetgeneconnecttedentryvectorpB2E-T,c:hpil3tagetgeneconnectedoverexpressvectorpCAMBIA1300-DEST2.3.4hpil3目標基因超表達植株的轉(zhuǎn)化將構(gòu)建完成的含野生型目標基因的超表達載體通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化hpil3(圖2.5),轉(zhuǎn)化工作由上海博益生物公司完成。
沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文41株則表現(xiàn)出高抗(圖2.6)。這與分子鑒定的結(jié)果相一致,說明該候選基因就是突變體hpil3的目標基因。圖2.6轉(zhuǎn)基因植株表型鑒定和分子鑒定A、B:轉(zhuǎn)基因的hpil3植株;C:轉(zhuǎn)基因hpil3植株的抗性鑒定和分子鑒定hpil3-OE:轉(zhuǎn)基因陽性植株;hpil3-VA:轉(zhuǎn)基因陰性植株A、B:thephenotypeoftransgenichpil3;C:theresistanceidentificationandmolecularidentificationoftransgenichpil3;hpil3-OE:positiveplantbytransgenosis;hpil3-VA:nagativeplantbytransgenosis2.4討論本試驗通過基于基因組重測序的圖位克隆的方法將hpil3的目標基因定位在4號染色體20-22Mb區(qū)間,進一步篩選得到7個候選基因,在NCBI和RAP-DB等網(wǎng)站的基因信息比對后最終將一個可能性最大候選基因做水稻轉(zhuǎn)基因功能互補驗證,得到17株恢復(fù)野生表型的轉(zhuǎn)基因植株和4株未恢復(fù)植株。對它們做白葉枯病抗性鑒定,結(jié)果表明表型恢復(fù)的植株跟其野生型一樣對白葉枯病菌表現(xiàn)出高感,而未恢復(fù)的植株跟突變體一樣是高抗的。這進一步驗證了該候選基因就是hpil3的目標基因。查閱文獻發(fā)現(xiàn)該基因是未被報道過的一個水稻類病變新基因。其在網(wǎng)站RiceGenomeAnnotationProject
【參考文獻】:
期刊論文
[1]木質(zhì)部次生細胞壁增厚參與疣粒野生稻對黃單胞桿菌水稻變種的抗性(英文)[J]. 楊勇,謝禮,嚴成其,王栩鳴,余初浪,成曉越,程曄,陳劍平. 植物病理學(xué)報. 2012(05)
[2]利用基因組文庫加速Xa23基因定位的染色體步移[J]. 王春連,陳樂天,曾超珍,張群宇,劉丕慶,劉耀光,樊穎倫,章琦,趙開軍. 中國水稻科學(xué). 2006(04)
[3]疣粒野生稻原生質(zhì)體再生小植株[J]. 朱永生,陳葆棠,秦發(fā)蘭,余舜武,張端品. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué). 2002(12)
博士論文
[1]中國番茄黃化曲葉病毒衛(wèi)星DNA抑制轉(zhuǎn)錄后基因沉默的機理研究[D]. 李方方.浙江大學(xué) 2014
[2]Xa13基因在水稻—白葉枯病菌互作和水稻生長發(fā)育中的功能研究[D]. 袁猛.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2010
[3]Rubisco活化酶大小同工型與水稻光合作用的關(guān)系研究[D]. 王盾.浙江大學(xué) 2009
本文編號:3066231
【文章來源】:沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)遼寧省
【文章頁數(shù)】:140 頁
【學(xué)位級別】:博士
【部分圖文】:
用基因組重測序的方法定位突變體hpil3目標基因Fig.2.3Genemappingofhpil3throughgenomeresequencing
沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文392.3.3hpil3候選目標基因的克隆和超表達載體的構(gòu)建將提取好的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,用全長引物15M41F/R進行擴增(圖2.4-a)。先將PCR產(chǎn)物凝膠純化回收,先與入門載體pB2E-T連接(圖2.4-b),再將目標片段通過LR反應(yīng)轉(zhuǎn)移至超表達載體pCAMBIA1300-DEST中(圖2.4-c)。圖2.4hpil3候選目標基因的檢測a:目標基因的克隆;b:目標基因連接入門載體pB2E-T的檢測圖片;c:目標基因連接超表達載體pCAMBIA1300-DESTFig.2.4testoncandidategeneofhpil3a:thetestpictureofhpil3tagetgenecloned,b:thetestpictureofhpil3tagetgeneconnecttedentryvectorpB2E-T,c:hpil3tagetgeneconnectedoverexpressvectorpCAMBIA1300-DEST2.3.4hpil3目標基因超表達植株的轉(zhuǎn)化將構(gòu)建完成的含野生型目標基因的超表達載體通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化hpil3(圖2.5),轉(zhuǎn)化工作由上海博益生物公司完成。
沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文41株則表現(xiàn)出高抗(圖2.6)。這與分子鑒定的結(jié)果相一致,說明該候選基因就是突變體hpil3的目標基因。圖2.6轉(zhuǎn)基因植株表型鑒定和分子鑒定A、B:轉(zhuǎn)基因的hpil3植株;C:轉(zhuǎn)基因hpil3植株的抗性鑒定和分子鑒定hpil3-OE:轉(zhuǎn)基因陽性植株;hpil3-VA:轉(zhuǎn)基因陰性植株A、B:thephenotypeoftransgenichpil3;C:theresistanceidentificationandmolecularidentificationoftransgenichpil3;hpil3-OE:positiveplantbytransgenosis;hpil3-VA:nagativeplantbytransgenosis2.4討論本試驗通過基于基因組重測序的圖位克隆的方法將hpil3的目標基因定位在4號染色體20-22Mb區(qū)間,進一步篩選得到7個候選基因,在NCBI和RAP-DB等網(wǎng)站的基因信息比對后最終將一個可能性最大候選基因做水稻轉(zhuǎn)基因功能互補驗證,得到17株恢復(fù)野生表型的轉(zhuǎn)基因植株和4株未恢復(fù)植株。對它們做白葉枯病抗性鑒定,結(jié)果表明表型恢復(fù)的植株跟其野生型一樣對白葉枯病菌表現(xiàn)出高感,而未恢復(fù)的植株跟突變體一樣是高抗的。這進一步驗證了該候選基因就是hpil3的目標基因。查閱文獻發(fā)現(xiàn)該基因是未被報道過的一個水稻類病變新基因。其在網(wǎng)站RiceGenomeAnnotationProject
【參考文獻】:
期刊論文
[1]木質(zhì)部次生細胞壁增厚參與疣粒野生稻對黃單胞桿菌水稻變種的抗性(英文)[J]. 楊勇,謝禮,嚴成其,王栩鳴,余初浪,成曉越,程曄,陳劍平. 植物病理學(xué)報. 2012(05)
[2]利用基因組文庫加速Xa23基因定位的染色體步移[J]. 王春連,陳樂天,曾超珍,張群宇,劉丕慶,劉耀光,樊穎倫,章琦,趙開軍. 中國水稻科學(xué). 2006(04)
[3]疣粒野生稻原生質(zhì)體再生小植株[J]. 朱永生,陳葆棠,秦發(fā)蘭,余舜武,張端品. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué). 2002(12)
博士論文
[1]中國番茄黃化曲葉病毒衛(wèi)星DNA抑制轉(zhuǎn)錄后基因沉默的機理研究[D]. 李方方.浙江大學(xué) 2014
[2]Xa13基因在水稻—白葉枯病菌互作和水稻生長發(fā)育中的功能研究[D]. 袁猛.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2010
[3]Rubisco活化酶大小同工型與水稻光合作用的關(guān)系研究[D]. 王盾.浙江大學(xué) 2009
本文編號:3066231
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