水稻白葉枯病是由Xanthomonas oryzae pv.oryzae（Xoo）引起的一種毀滅性病害,可造成水稻大量減產(chǎn)�？共∑贩N的利用是一種經(jīng)濟(jì)且對(duì)環(huán)境友好的防治手段,但是其前提是需要不斷挖掘新的抗白葉枯病基因資源并明確抗病基因功能。本研究利用前期誘變獲得的廣譜高抗白葉枯病的水稻類病變突變體hpil3開(kāi)展了抗病目標(biāo)基因定位、克隆,蛋白組學(xué),目標(biāo)基因的互作基因篩選等相關(guān)研究,同時(shí)對(duì)疣粒野生稻中RCA在抗白葉枯病中的作用機(jī)理進(jìn)行了研究。主要研究成果如下:利用hpil3和其野生型大粒香水稻通過(guò)基于重測(cè)序的圖位克隆策略成功定位并克隆了該突變體的目標(biāo)基因。該基因定位在4號(hào)染色體的20-22Mb區(qū)域內(nèi),進(jìn)一步篩選得到7個(gè)候選的基因。通過(guò)對(duì)突變位點(diǎn)的驗(yàn)證和生物信息學(xué)分析最終確定了一個(gè)可能性較大的候選基因。轉(zhuǎn)基因功能互補(bǔ)驗(yàn)證結(jié)果表明,該野生型基因成功使hpil3的表型恢復(fù)為野生型并喪失了對(duì)白葉枯病的抗性,從而確證了該候選基因就是hpil3的目標(biāo)基因。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR發(fā)現(xiàn)hpil3中病程相關(guān)基因PR1a、PR1b、PR5、PR10表達(dá)量顯著高于其野生型大粒香（DLX）,而PR9略高于DLX;未... 

【文章來(lái)源】：沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)遼寧省

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【學(xué)位級(jí)別】：博士

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用基因組重測(cè)序的方法定位突變體hpil3目標(biāo)基因Fig.2.3Genemappingofhpil3throughgenomeresequencing

沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文392.3.3hpil3候選目標(biāo)基因的克隆和超表達(dá)載體的構(gòu)建將提取好的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，用全長(zhǎng)引物15M41F/R進(jìn)行擴(kuò)增（圖2.4-a）。先將PCR產(chǎn)物凝膠純化回收，先與入門(mén)載體pB2E-T連接（圖2.4-b），再將目標(biāo)片段通過(guò)LR反應(yīng)轉(zhuǎn)移至超表達(dá)載體pCAMBIA1300-DEST中（圖2.4-c）。圖2.4hpil3候選目標(biāo)基因的檢測(cè)a:目標(biāo)基因的克隆;b:目標(biāo)基因連接入門(mén)載體pB2E-T的檢測(cè)圖片;c:目標(biāo)基因連接超表達(dá)載體pCAMBIA1300-DESTFig.2.4testoncandidategeneofhpil3a:thetestpictureofhpil3tagetgenecloned,b:thetestpictureofhpil3tagetgeneconnecttedentryvectorpB2E-T,c:hpil3tagetgeneconnectedoverexpressvectorpCAMBIA1300-DEST2.3.4hpil3目標(biāo)基因超表達(dá)植株的轉(zhuǎn)化將構(gòu)建完成的含野生型目標(biāo)基因的超表達(dá)載體通過(guò)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化hpil3（圖2.5），轉(zhuǎn)化工作由上海博益生物公司完成。

沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文41株則表現(xiàn)出高抗（圖2.6）。這與分子鑒定的結(jié)果相一致，說(shuō)明該候選基因就是突變體hpil3的目標(biāo)基因。圖2.6轉(zhuǎn)基因植株表型鑒定和分子鑒定A、B：轉(zhuǎn)基因的hpil3植株；C：轉(zhuǎn)基因hpil3植株的抗性鑒定和分子鑒定hpil3-OE：轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株；hpil3-VA：轉(zhuǎn)基因陰性植株A、B：thephenotypeoftransgenichpil3;C:theresistanceidentificationandmolecularidentificationoftransgenichpil3；hpil3-OE：positiveplantbytransgenosis；hpil3-VA：nagativeplantbytransgenosis2.4討論本試驗(yàn)通過(guò)基于基因組重測(cè)序的圖位克隆的方法將hpil3的目標(biāo)基因定位在4號(hào)染色體20-22Mb區(qū)間，進(jìn)一步篩選得到7個(gè)候選基因，在NCBI和RAP-DB等網(wǎng)站的基因信息比對(duì)后最終將一個(gè)可能性最大候選基因做水稻轉(zhuǎn)基因功能互補(bǔ)驗(yàn)證，得到17株恢復(fù)野生表型的轉(zhuǎn)基因植株和4株未恢復(fù)植株。對(duì)它們做白葉枯病抗性鑒定，結(jié)果表明表型恢復(fù)的植株跟其野生型一樣對(duì)白葉枯病菌表現(xiàn)出高感，而未恢復(fù)的植株跟突變體一樣是高抗的。這進(jìn)一步驗(yàn)證了該候選基因就是hpil3的目標(biāo)基因。查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)該基因是未被報(bào)道過(guò)的一個(gè)水稻類病變新基因。其在網(wǎng)站RiceGenomeAnnotationProject

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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博士論文
[1]中國(guó)番茄黃化曲葉病毒衛(wèi)星DNA抑制轉(zhuǎn)錄后基因沉默的機(jī)理研究[D]. 李方方.浙江大學(xué) 2014
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