目的:在對皮膚T細(xì)胞淋巴瘤（Cutaneous T cell lymphoma,CTCL）病人的研究中發(fā)現(xiàn),有3個樣本的基因組DNA在Plcg1（phospholipase C gamma 1,Plcg1）基因產(chǎn)生突變,其中2個樣本在第11號外顯子中具有冗余突變（c.1034T>C,p.S345F）,進(jìn)而影響PLCγ蛋白催化結(jié)構(gòu)域。為了探究該突變與CTCL發(fā)病的相關(guān)性,計劃構(gòu)建PLCγ1（S345F）基因點突變小鼠并初步分析其免疫細(xì)胞的變化情況,為進(jìn)一步尋找CTCL發(fā)病的作用機制研究奠定基礎(chǔ)。在生發(fā)中心B細(xì)胞對初始B細(xì)胞的基因表達(dá)差異分析中發(fā)現(xiàn)Sik1基因的高表達(dá),但是具體作用尚未明確,構(gòu)建Sik1基因敲除小鼠將促進(jìn)Sik1基因在免疫系統(tǒng)中作用的研究。方法:CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)以其設(shè)計簡單、效率高的優(yōu)點在生物研究領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。依據(jù)其原理我們在小鼠Plcg1基因和Sik1基因靶位點附近設(shè)計sgRNA,進(jìn)行原核顯微注射;測序確定小鼠基因型;流式細(xì)胞術(shù)分析PLCγ1（S345F）基因點突變小鼠和野生型小鼠的淋巴細(xì)胞及其亞群的變化。結(jié)果:PCR測序確定得到PLCγ1（S... 

【文章來源】：福建師范大學(xué)福建省

【文章頁數(shù)】：104 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

PLCγ1(S345F)基因點突變小鼠模型設(shè)計方案

第一章敲除質(zhì)粒的構(gòu)建和功能驗證-19-圖1-1PLCγ1(S345F)基因點突變小鼠模型設(shè)計方案Fig.1-1DesignschemeofmousePLCγ1(S345F)genepointmutationmousemodel1.2.2Sik1-ko小鼠模型設(shè)計方法小鼠Sik1基因共有14個外顯子，其翻譯起始位點ATG在第2號外顯子上，因此我們計劃在第2號外顯子上、起始密碼子ATG之后設(shè)計sgRNA，通過顯微注射技術(shù)將sgRNA和Cas9蛋白注射到小鼠受精卵中，以期構(gòu)建Sik1基因敲除小鼠模型，并利用該模型對相關(guān)疾病的產(chǎn)生及其機制發(fā)生進(jìn)行深入研究。根據(jù)CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)原理，Cas9蛋白會靶向切割DNA，形成雙鏈缺口，通過非同源末端連接的DNA修復(fù)機制，從而造成Sik1基因的的閱讀框發(fā)生改變，使Sik1基因失去原先的功能（圖1-2）。圖1-2Sik1-ko小鼠模型設(shè)計方案Fig.1-2Sik1-komousemodeldesign

福建師范大學(xué)莊依凡碩士學(xué)位論文-32-圖1-3左側(cè)Donor在基因組上的位置Fig.1-3LocationoftheleftDonoronthegenome圖1-4右側(cè)Donor在基因組上的位置Fig.1-4LocationoftherightDonoronthegenome1.2.7.2點突變Donor的功能驗證通過PCR的方法合成Donor之后，為了進(jìn)一步驗證我們合成的Donor是否有效，我們將敲除質(zhì)粒PX459-Plcg1-ki(C>T)-sg1（ki1）和Donor進(jìn)行組合，然后轉(zhuǎn)染L929細(xì)胞，利用嘌呤霉素來進(jìn)行篩選，并使用有限稀釋法獲得單克隆細(xì)胞株。我們針對每一種組合挑取12個單克隆細(xì)胞株。獲得細(xì)胞株以后我們提取這些細(xì)胞株的基因組DNA，對目標(biāo)序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增后將PCR產(chǎn)物送測序（引物與細(xì)胞株驗證引物一致，見附表2），通過比對序列，最終確定該Donor是否有效。比對軟件為Bioedit。1.3結(jié)果與分析1.3.1PLCγ1敲除重組質(zhì)粒的鑒定1.3.1.1敲除重組質(zhì)粒的鑒定經(jīng)過上一章的sgRNA的合成、退火、與PX459線性載體連接、轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞、菌液測序之后，我們比對測序結(jié)果序列（圖1-5），表明Plcg1基因的敲除載體已經(jīng)成功構(gòu)建。


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