目的:在對皮膚T細胞淋巴瘤（Cutaneous T cell lymphoma,CTCL）病人的研究中發(fā)現(xiàn),有3個樣本的基因組DNA在Plcg1（phospholipase C gamma 1,Plcg1）基因產(chǎn)生突變,其中2個樣本在第11號外顯子中具有冗余突變（c.1034T>C,p.S345F）,進而影響PLCγ蛋白催化結構域。為了探究該突變與CTCL發(fā)病的相關性,計劃構建PLCγ1（S345F）基因點突變小鼠并初步分析其免疫細胞的變化情況,為進一步尋找CTCL發(fā)病的作用機制研究奠定基礎。在生發(fā)中心B細胞對初始B細胞的基因表達差異分析中發(fā)現(xiàn)Sik1基因的高表達,但是具體作用尚未明確,構建Sik1基因敲除小鼠將促進Sik1基因在免疫系統(tǒng)中作用的研究。方法:CRISPR/Cas9基因編輯技術以其設計簡單、效率高的優(yōu)點在生物研究領域得到廣泛應用。依據(jù)其原理我們在小鼠Plcg1基因和Sik1基因靶位點附近設計sgRNA,進行原核顯微注射;測序確定小鼠基因型;流式細胞術分析PLCγ1（S345F）基因點突變小鼠和野生型小鼠的淋巴細胞及其亞群的變化。結果:PCR測序確定得到PLCγ1（S... 

【文章來源】：福建師范大學福建省

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【學位級別】：碩士

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PLCγ1(S345F)基因點突變小鼠模型設計方案

第一章敲除質粒的構建和功能驗證-19-圖1-1PLCγ1(S345F)基因點突變小鼠模型設計方案Fig.1-1DesignschemeofmousePLCγ1(S345F)genepointmutationmousemodel1.2.2Sik1-ko小鼠模型設計方法小鼠Sik1基因共有14個外顯子，其翻譯起始位點ATG在第2號外顯子上，因此我們計劃在第2號外顯子上、起始密碼子ATG之后設計sgRNA，通過顯微注射技術將sgRNA和Cas9蛋白注射到小鼠受精卵中，以期構建Sik1基因敲除小鼠模型，并利用該模型對相關疾病的產(chǎn)生及其機制發(fā)生進行深入研究。根據(jù)CRISPR/Cas9基因編輯技術原理，Cas9蛋白會靶向切割DNA，形成雙鏈缺口，通過非同源末端連接的DNA修復機制，從而造成Sik1基因的的閱讀框發(fā)生改變，使Sik1基因失去原先的功能（圖1-2）。圖1-2Sik1-ko小鼠模型設計方案Fig.1-2Sik1-komousemodeldesign

福建師范大學莊依凡碩士學位論文-32-圖1-3左側Donor在基因組上的位置Fig.1-3LocationoftheleftDonoronthegenome圖1-4右側Donor在基因組上的位置Fig.1-4LocationoftherightDonoronthegenome1.2.7.2點突變Donor的功能驗證通過PCR的方法合成Donor之后，為了進一步驗證我們合成的Donor是否有效，我們將敲除質粒PX459-Plcg1-ki(C>T)-sg1（ki1）和Donor進行組合，然后轉染L929細胞，利用嘌呤霉素來進行篩選，并使用有限稀釋法獲得單克隆細胞株。我們針對每一種組合挑取12個單克隆細胞株。獲得細胞株以后我們提取這些細胞株的基因組DNA，對目標序列進行PCR擴增后將PCR產(chǎn)物送測序（引物與細胞株驗證引物一致，見附表2），通過比對序列，最終確定該Donor是否有效。比對軟件為Bioedit。1.3結果與分析1.3.1PLCγ1敲除重組質粒的鑒定1.3.1.1敲除重組質粒的鑒定經(jīng)過上一章的sgRNA的合成、退火、與PX459線性載體連接、轉化感受態(tài)細胞、菌液測序之后，我們比對測序結果序列（圖1-5），表明Plcg1基因的敲除載體已經(jīng)成功構建。


本文編號：3064518