隨著現(xiàn)代工業(yè)、農(nóng)業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)高速發(fā)展,環(huán)境污染問題日益嚴(yán)重。據(jù)2018年中國環(huán)境狀況公報(bào)報(bào)道,氮污染位于眾多污染首位。人類活動(dòng)對氮循環(huán)的干擾極大地加速了地球生態(tài)環(huán)境的變化,引發(fā)嚴(yán)重的氮循環(huán)失衡、氮污染加劇、溫室氣體排放增多等不良效應(yīng),及時(shí)有效地解決氮污染問題刻不容緩。微生物在治理氮污染等方面發(fā)揮了重要的作用,氨氧化是氮污染治理的重要環(huán)節(jié),目前研究和應(yīng)用的氨氧化菌主要是從環(huán)境中分離純化的菌株,或者克隆某種單一微生物的氨氧化酶基因（amoA）構(gòu)建其工程菌。為了進(jìn)一步提高氨氧化菌（AOB）的篩選效率,本文構(gòu)建了環(huán)境樣品自養(yǎng)氨氧化菌群amo A基因文庫,通過對重組子活性的篩選,獲得高活性AmoA,進(jìn)一步采用定向進(jìn)化技術(shù),構(gòu)建amoA突變文庫并篩選高活性AmoA重組子,將篩選到的amoA與羥胺氧化酶基因（hao）在宿主菌種共表達(dá),以期獲得高活性AOB。本研究的主要結(jié)果如下:（1）氨單加氧酶（AmoA）初篩體系的建立:以Pseudomonas（P.）aeruginosa ATCC9027的amoA,構(gòu)建工程菌E.coli BL21（amoA）,建立了一種原位測定AmoA活性的方法,挑取重組子于96孔... 

【文章來源】：華僑大學(xué)福建省

【文章頁數(shù)】：88 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

技術(shù)路線圖

192.3.4.4AmoA高通量活性篩選體系的確立在已經(jīng)優(yōu)化的溶菌酶濃度和溶菌酶作用時(shí)間下將96孔板中的細(xì)菌菌體破碎。再向每個(gè)孔中加入終濃度為100mg/L的NH4+-N，反應(yīng)30min后，向其中依次加入10μL的乙酸-乙酸鈉緩沖液，10μL的FAS使用液和10μL的鄰菲羅啉溶液，搖勻靜置40min后，用10mm比色皿，在510nm波長下測定其吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出羥胺的含量。2.4結(jié)果2.4.1重組菌E.coliBL21(amoA)的構(gòu)建2.4.1.1基因組DNA和質(zhì)粒pETDuet-1的檢測參照細(xì)菌基因組DNA快速抽提試劑盒提取P.aeruginosaATCC9027基因組DNA。經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖2.1(A)，圖示顯示目的條帶大于15kb，可知成功提取到P.aeruginosaATCC9027基因組DNA，經(jīng)超微量紫外分光光度計(jì)測得其濃度為265.4ng/μL，OD260/OD280比值為1.79，純度符合要求，可用于下一步擴(kuò)增目的基因。參照SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒提取pETDuet-1質(zhì)粒，結(jié)果如圖2.1(B)。圖2.1基因組DNA(A)和質(zhì)粒載體pETDuet-1(B)的瓊脂糖凝膠電泳檢測圖A：LaneM：DNAMarker15K；Lane1：基因組DNA；Lane2：陰性對照組；圖BLaneM：DNAMarker2K；Lane1：質(zhì)粒pETDuet-1；Lane2：陰性對照組。Fig.2.1DectectionofgenomicDNA(A)andpETDuet-1(B)byagarosegelelectrophoresis.A:LaneM,DNAMarker15K;Lane1,genomicDNA.Lane2,negativecontrol.B:LaneM,DNAMarker2K;Lane1,theextractedpETDuet-1plasmid.Lane2,negativecontrol.2.4.1.2amoA基因的擴(kuò)增amoA基因PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖2.2，結(jié)果顯示Lane2-6在1000bp與2000bp之間出現(xiàn)了大小與目的基因amoA(1038bp)相符的單一條帶。通過切膠回收目的

20條帶，經(jīng)超微量紫外分光光度計(jì)檢測，得純化回收后產(chǎn)物濃度分別為amoA：92.5ng/μL；OD260/OD280比值為1.7-1.9之間，符合后續(xù)的實(shí)驗(yàn)要求。圖2.2amoA基因瓊脂糖凝膠電泳檢測Lane2-6：amoA基因PCR檢測；LaneM：DNAMarkerDL2000；Lane1：陰性對照組；Fig.2.2DectectionofaimedamoAgenebyagarosegelelectrophoresis.Lane2-6,theamplifiedamoAgene;LaneM,DNAMarkerDL2000.Lane1,negativecontrol.2.4.1.3重組菌E.coliBL21(amoA)的構(gòu)建目的基因amoA經(jīng)雙酶切后與質(zhì)粒pETDuet-1經(jīng)T4連接酶連接后轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞E.coliBL21中，復(fù)蘇后取100μL于涂布于卡納抗生素的LB平板上，37℃恒溫培養(yǎng)12h，在含氨芐霉素培養(yǎng)皿上長出大量單菌落見，圖2.3。圖2.3涂布平板后E.coliBL21轉(zhuǎn)化菌的生長情況Fig.2.3ThegrowthoftransformedE.coliBL21.2.4.1.4重組菌E.coliBL21(amoA)的篩選將雙酶切的目的基因amoA與pETDuet-1質(zhì)粒經(jīng)T4連接酶連接后轉(zhuǎn)化至感受態(tài)E.coliDH5α，經(jīng)復(fù)蘇后取100μL菌液涂布于含氨芐青霉素的LB平板，37℃恒溫過夜培養(yǎng)，挑取單菌落，通過菌落PCR和雙酶切的方法對重組質(zhì)粒進(jìn)行鑒定并保種。菌落PCR結(jié)果如圖所示2.4(A)，條帶分別于目的基因大小相符，將陽性重組菌擴(kuò)大培養(yǎng)，提取其質(zhì)粒后進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，酶切結(jié)果如圖2.4(B)。重組菌中的質(zhì)粒經(jīng)雙酶切后，出現(xiàn)與線性質(zhì)粒和目的基因amoA大小一致的兩條條帶。將連接成功的質(zhì)粒pETDuet-1-amoA轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌株BL21中，成功構(gòu)建重組菌E.coliBL21(pETDuet-1-amoA)。


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