基因表達系統(tǒng)在研究代謝途徑、信號通路、基因表達調(diào)控等方面都起到重要作用。其被廣泛的應(yīng)用于生物、食品、工業(yè)以及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域,以原核生物細胞及真核生物細胞作為表達系統(tǒng),進行目的基因序列的表達以生產(chǎn)蛋白疫苗、核酸疫苗和生物酶制劑等是近年來發(fā)酵工業(yè)的新型領(lǐng)域。誘導(dǎo)基因表達系統(tǒng)是一種特異性、高效率及劑量依賴性的系統(tǒng),該系統(tǒng)已經(jīng)成功的應(yīng)用于酶、多肽、中間代謝物等表達產(chǎn)物的生產(chǎn),對食品、醫(yī)藥、保健業(yè)和工業(yè)等領(lǐng)域大發(fā)展起到極大的推動作用。通過利用強啟動子將克隆基因整合到染色體上,構(gòu)建高效的誘導(dǎo)性表達載體,通過不同的誘導(dǎo)方法,實現(xiàn)外源蛋白的高效表達。目前,對于變異鏈球菌的誘導(dǎo)系統(tǒng)構(gòu)建已有相關(guān)研究,但將該系統(tǒng)與轉(zhuǎn)座系統(tǒng)相結(jié)合用于探究一些相關(guān)基因的功能等方面尚且不足。本論文以變異鏈球菌（Streptococcus mutans）UA159為研究對象,旨在構(gòu)建一個適用于該菌的一個能夠有效控制基因表達以及能與轉(zhuǎn)座系統(tǒng)相結(jié)合的誘導(dǎo)型表達系統(tǒng)。主要研究結(jié)果如下:（1）在變異鏈球菌UA159中將轉(zhuǎn)座元件與已有的兩個木糖誘導(dǎo)系統(tǒng)S2和S1結(jié)合構(gòu)建了兩個轉(zhuǎn)座載體 pLH475（pLH1 45::gyrAp::xylR::xy... 

【文章來源】：天津科技大學(xué)天津市

【文章頁數(shù)】：61 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖２－１?ｐＳＥＴ４ｓ圖譜??Ｆｉｇ．?２－１?Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｄｉａｇｒａｍ?ｏｆ?ｐｌａｓｍｉｄ?ｐＳＥＴ４ｓ??

?天津科技大學(xué)碩士學(xué)位論文???３．１．３轉(zhuǎn)座載體ｐＬＨ６３０構(gòu)建??實驗構(gòu)建了用于轉(zhuǎn)座載體ＰＬＨ６３０，通過一系列的ＰＣＲ分別以質(zhì)粒ｐＬＨ４７５和質(zhì)？??粒ｐＺＸ９為模板獲得三個片段后再通過Ｇｏｌｄｅｎ?Ｇａｔｅ?Ｃｌｏｎｉｎｇ方法連接后轉(zhuǎn)化及驗證，?．??最終成功獲得啟動子由：ｃ＿ｙ／Ａｐ換成／洲ｐ的質(zhì)粒ｐＬＨ６３０。構(gòu)建圖譜如下：??ｆ?ＰＬＨ４７５〕ｆ?－３０?Ｖ－??Ｖ?７９７９?ｂｐ?Ｖ?７９２９ｂｐ??ｓｐｃ－＾??圖３－５載體ｐＬＨ６３０的構(gòu)建流程圖??Ｆｉｇ．?３－５?Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ?ｏｆ?ｖｅｃｔｏｒ?ｐＬＨ４６３０??實驗選用Ｐｒｉｍｅｒ?ＳＴＡＲ?ＤＮＡ?Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，以質(zhì)粒ｐＬＨ４７５和ｐＺＸ９作為模板根據(jù)??上述２．２．９．Ｉ操作進行，由此得到的三個片段如圖３－６（ａ）、（ｂ）、（ｃ）所示，長度分別約為??４０５２、１５４、３７２９?ｂｐ。將ＰＣＲ獲得三個片段按照Ｇｏｌｄｅｎ?Ｇａｔｅ?Ｃｌｏｎｉｎｇ方法進行連接后，??再按照上述２．２．７．６，?２．２．７．７進行操作，進行連接、化轉(zhuǎn)，菌落ＰＣＲ驗證，電泳結(jié)果??如圖３－６?（ｄ）所示，１、２號條帶與預(yù)期大小一致，對１、２號轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒并且用Ｑｕｉｔ??５ａｍＨ?Ｉ和Ｑｕｉｔ?ＥｃｏＲ?Ｉ進行酶切驗證，電泳結(jié)果如圖３－６?（ｅ）所示，１、２號都有與預(yù)期??大小一致的條帶，現(xiàn)象表明ＰＬＨ６３０構(gòu)建完成。??１?２?Ｍ?１?２?Ｍ?Ｍ?１?２??（ａ）?（ｂ）?（ｃ）??２９??

?３結(jié)果與討論???Ｍ?Ｎ?Ｐ?１?２?３?Ｍ?１?２??鍾蠢：＿漏＿議議??ＪＰ１?＾１??１〇〇ｂｆ＾－＾￡＾??（ｄ）?（ｅ）??圖３－６轉(zhuǎn)座載體ｐＬＨ６３０的構(gòu)建結(jié)果??Ｆｉｇ．?３－６?Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ?ｒｅｓｕｌｔ?ｏｆ?ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ?ｖｅｃｔｏｒ?ｐＬＨ６３０??Ｍ：?ＤＮＡＬａｄｄｅｒ；?Ｎ：陰性對照；Ｐ：陽性對照；（ａ）質(zhì)粒ｐＬＨ４７５為模板擴增片段丨；（ｂ）以??質(zhì)粒ｐＺＸ９為模板擴增的包含／外的片段；（ｃ）以ＰＬＨ４７５為模板進行擴増的片段３；?（ｄ）?ｐＬＨ６３０??菌落ＰＣＲ驗證；（ｅ）將菌落ＰＣＲ驗證正確的轉(zhuǎn)座子提取質(zhì)粒進行酶切驗證??實驗中構(gòu)建的質(zhì)粒ＰＬＨ４７５與質(zhì)粒ｐＬＨ６３０的區(qū)別是，前者的啟動子為ｘｙ／Ａｐ后者??啟動子為Ｗ／？ｐ，其啟動子結(jié)構(gòu)如下圖３－７?（ａ）、３－７?（ｂ）所不；??Ａ?＼?＾?｜＼??——：ｓｅ?ｍ—??％?（ａ）??ｘｙＩＡ％??－＾Ｌｍ—■?丨圓：＇＇?（ｂ）??＾?ｌｉ－＂．…ｖ??ｖｘ－ｖ＇Ｘ＇－??圖３－７質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖??Ｆｉｇ．?３－７?Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｄｉａｇｒａｍ?ｏｆ?ｐｌａｓｍｉｄ?ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ??（ａ）質(zhì)粒ｐＬＨ４７５啟動子結(jié)構(gòu)；（ｂ）質(zhì)粒ｐＬＨ６３０啟動子結(jié)構(gòu)??３０??

【參考文獻】：
碩士論文
[1]赤蘚糖醇對變異鏈球菌在蔗糖中生長、黏附及基因表達影響的實驗研究[D]. 蘇盟盟.福建醫(yī)科大學(xué) 2017



本文編號：3037587