目的利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除L02和L6細胞的TBC1D15基因,從細胞水平上研究TBC1D15與糖代謝的關(guān)系,為新型降糖藥物設(shè)計提供潛在靶標(biāo)。方法首先針對大鼠Tbc1d15基因的CDS序列設(shè)計并構(gòu)建5個包含sgRNA序列的pX459重組載體。通過MTT實驗確定L02和L6細胞的最佳嘌呤霉素篩選濃度,隨后用已有的pX462重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染L02細胞,用pX459重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染L6細胞,利用T7E1核酸內(nèi)切酶檢測敲除效率,用有限稀釋法篩選出單克隆細胞株,然后利用Western Blotting和基因組PCR分別驗證TBC1D15在蛋白水平和基因組水平的變化。在功能研究方面,通過2-NBDG葡萄糖熒光類似物培養(yǎng),經(jīng)流式細胞儀檢測糖吸收情況。利用Western Blotting技術(shù)檢測了胰島素刺激下野生型和TBC1D15^-/-細胞的GLUT4、Rab7和LC3B的表達變化。篩選能在10¹4 d殺死全部L02和L6細胞的最低G-418濃度,構(gòu)建HA-GLUT4-EGFP表達載體,轉(zhuǎn)染野生型和TBC1D15^-/-L02細胞,篩... 

【文章來源】：浙江理工大學(xué)浙江省

【文章頁數(shù)】：65 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

內(nèi)源性DNA修復(fù)機制[1]

圖 1.2 GLUT4 結(jié)構(gòu)圖[30]Figure 1.2 Structural features of the insulin-regulated GLUT4萄糖轉(zhuǎn)運蛋白的分布不同類型的細胞中，GLUT 蛋白的表達具有較大差異[27]。GLUT1 在所有細胞用來維持基礎(chǔ)葡萄糖的攝取，GLUT2 主要表達在肝細胞和胰島 β 細胞，GL中表達，GLUT5 表達在腸上皮和睪丸，GLUT6 在脾臟，白細胞和腦中均有是，GLUT8 定位在細胞質(zhì)中的囊泡上，伴隨著糖基化蛋白的降解，GLUT8溶酶體運輸?shù)郊毎|(zhì)中[31]。GLUT9 在肝臟和腎臟中表達，GLUT10 在肝臟和GLUT11 存在于肌肉中，GLUT12 在心臟和前列腺中表達。受胰島素刺激4 主要在肌肉和脂肪組織表達，也在腦的特定區(qū)域表達，例如下丘腦，進行胰葡萄糖傳感和代謝調(diào)節(jié)[32]。UT4 的轉(zhuǎn)運過程

士學(xué)位論文 TBC1D15 基因糖代謝位到細胞膜上，而不是影響細胞內(nèi) GLUT4 的總量。運動也會使膜上，在響應(yīng)運動和胰島素刺激時，骨骼肌中某種分子開關(guān)平，但是這 2 種刺激激活這種分子開關(guān)的信號傳導(dǎo)通路不同[33, 在進食后胰島素喪失了促進糖攝取的功能，但是運動后 GLUTUT4 的分子開關(guān)在 2 型糖尿病患者的肌肉中還是完整的，而是這個原因，GLUT4 運輸過程中的相關(guān)蛋白成為研究治療 2 型糖化合物與相關(guān)蛋白作用，能在胰島素信號缺失的情況下使 GL進葡萄糖的攝取[35]。

【參考文獻】：
期刊論文
[1]CRISPR/Cas9在基因治療中的應(yīng)用研究進展[J]. 黃佳杞,黃秦特,章國衛(wèi).  浙江醫(yī)學(xué). 2017(17)
[2]CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)及其在動物基因組定點修飾中的應(yīng)用[J]. 周金偉,徐綺嬪,姚婧,余樹民,曹隨忠.  遺傳. 2015(10)

碩士論文
[1]TBC1D15基因的敲除細胞系構(gòu)建及其功能研究[D]. 程丹丹.浙江理工大學(xué) 2017
[2]蛋白激酶Akt生物學(xué)功能的初步研究[D]. 沈嵐.第四軍醫(yī)大學(xué) 2005



本文編號：3034628