發(fā)布時(shí)間：2021-02-15 09:57

　　目的利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除L02和L6細(xì)胞的TBC1D15基因,從細(xì)胞水平上研究TBC1D15與糖代謝的關(guān)系,為新型降糖藥物設(shè)計(jì)提供潛在靶標(biāo)。方法首先針對大鼠Tbc1d15基因的CDS序列設(shè)計(jì)并構(gòu)建5個(gè)包含sgRNA序列的pX459重組載體。通過MTT實(shí)驗(yàn)確定L02和L6細(xì)胞的最佳嘌呤霉素篩選濃度,隨后用已有的pX462重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染L02細(xì)胞,用pX459重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染L6細(xì)胞,利用T7E1核酸內(nèi)切酶檢測敲除效率,用有限稀釋法篩選出單克隆細(xì)胞株,然后利用Western Blotting和基因組PCR分別驗(yàn)證TBC1D15在蛋白水平和基因組水平的變化。在功能研究方面,通過2-NBDG葡萄糖熒光類似物培養(yǎng),經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測糖吸收情況。利用Western Blotting技術(shù)檢測了胰島素刺激下野生型和TBC1D15^-/-細(xì)胞的GLUT4、Rab7和LC3B的表達(dá)變化。篩選能在10¹4 d殺死全部L02和L6細(xì)胞的最低G-418濃度,構(gòu)建HA-GLUT4-EGFP表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染野生型和TBC1D15^-/-L02細(xì)胞,篩... 

【文章來源】：浙江理工大學(xué)浙江省

【文章頁數(shù)】：65 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

內(nèi)源性DNA修復(fù)機(jī)制[1]

圖 1.2 GLUT4 結(jié)構(gòu)圖[30]Figure 1.2 Structural features of the insulin-regulated GLUT4萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的分布不同類型的細(xì)胞中，GLUT 蛋白的表達(dá)具有較大差異[27]。GLUT1 在所有細(xì)胞用來維持基礎(chǔ)葡萄糖的攝取，GLUT2 主要表達(dá)在肝細(xì)胞和胰島 β 細(xì)胞，GL中表達(dá)，GLUT5 表達(dá)在腸上皮和睪丸，GLUT6 在脾臟，白細(xì)胞和腦中均有是，GLUT8 定位在細(xì)胞質(zhì)中的囊泡上，伴隨著糖基化蛋白的降解，GLUT8溶酶體運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)中[31]。GLUT9 在肝臟和腎臟中表達(dá)，GLUT10 在肝臟和GLUT11 存在于肌肉中，GLUT12 在心臟和前列腺中表達(dá)。受胰島素刺激4 主要在肌肉和脂肪組織表達(dá)，也在腦的特定區(qū)域表達(dá)，例如下丘腦，進(jìn)行胰葡萄糖傳感和代謝調(diào)節(jié)[32]。UT4 的轉(zhuǎn)運(yùn)過程

士學(xué)位論文 TBC1D15 基因糖代謝位到細(xì)胞膜上，而不是影響細(xì)胞內(nèi) GLUT4 的總量。運(yùn)動(dòng)也會(huì)使膜上，在響應(yīng)運(yùn)動(dòng)和胰島素刺激時(shí)，骨骼肌中某種分子開關(guān)平，但是這 2 種刺激激活這種分子開關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)通路不同[33, 在進(jìn)食后胰島素喪失了促進(jìn)糖攝取的功能，但是運(yùn)動(dòng)后 GLUTUT4 的分子開關(guān)在 2 型糖尿病患者的肌肉中還是完整的，而是這個(gè)原因，GLUT4 運(yùn)輸過程中的相關(guān)蛋白成為研究治療 2 型糖化合物與相關(guān)蛋白作用，能在胰島素信號(hào)缺失的情況下使 GL進(jìn)葡萄糖的攝取[35]。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]CRISPR/Cas9在基因治療中的應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 黃佳杞,黃秦特,章國衛(wèi).  浙江醫(yī)學(xué). 2017(17)
[2]CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)及其在動(dòng)物基因組定點(diǎn)修飾中的應(yīng)用[J]. 周金偉,徐綺嬪,姚婧,余樹民,曹隨忠.  遺傳. 2015(10)

碩士論文
[1]TBC1D15基因的敲除細(xì)胞系構(gòu)建及其功能研究[D]. 程丹丹.浙江理工大學(xué) 2017
[2]蛋白激酶Akt生物學(xué)功能的初步研究[D]. 沈嵐.第四軍醫(yī)大學(xué) 2005



本文編號(hào)：3034628