發(fā)布時間：2021-02-11 12:13

　　中國倉鼠卵巢（Chinese hamster ovary,CHO）細胞是首個被美國FDA、歐盟EMA和中國CFDA認可的用于生物制藥領(lǐng)域的生產(chǎn)細胞,已廣泛應(yīng)用于各種治療性蛋白質(zhì)藥物的大規(guī)模制備。CHO細胞在治療性蛋白質(zhì)藥物生產(chǎn)中的優(yōu)勢明確,但目前構(gòu)建重組的生產(chǎn)型CHO細胞株還一直停留在目的基因隨機整合,或基于外源基因倍增策略,通過篩選高表達細胞,以最終獲得工程化表達細胞的研究思路。這導致建立的生產(chǎn)型CHO細胞株的表達性狀的長期穩(wěn)定性欠缺,構(gòu)建生產(chǎn)型細胞株的效率低等問題。本研究以具有抗凋亡能力的CHO細胞株為研究材料,通過對穩(wěn)定表達外源性基因位點的確認,構(gòu)建了可以表達不同類型治療性重組蛋白質(zhì)的CHO表達細胞株,并對不同蛋白質(zhì)類藥物的表達穩(wěn)定性進行了認證,主要結(jié)果如下:（1）以CHO-K1細胞系為研究材料,采用CRISPR/Cas9技術(shù),通過CD513B-Cas9、sgRNA-BAK與sgRNA-BAX三個表達質(zhì)粒一次性共轉(zhuǎn)染,實現(xiàn)了對出發(fā)細胞凋亡相關(guān)基因的敲除。DNA序列測序發(fā)現(xiàn)實驗細胞的目標靶點處序列均有明確的插入/刪除;檢測實驗細胞均不再表達BAK與BAX蛋白質(zhì)。對比野生型CHO-K... 

【文章來源】：江南大學江蘇省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：108 頁

【學位級別】：博士

【部分圖文】：

表達目的蛋白的重組細胞株構(gòu)建及后期途徑工程培養(yǎng)細胞[9]

不同細胞系染色體的數(shù)目也不恒定[1]�；蚪M的不穩(wěn)定性，主要表現(xiàn)在其染色體層面上的拷貝數(shù)變異。早先的一項基于Giemsa-banding 技術(shù)檢測，顯示出中國倉鼠卵巢細胞擁有 22 條染色體，其中含 10 對常染色體及 2 條性染色體[21]。而 CHO-K1 細胞系則顯示出與其有極大的不同，其僅有8 條染色體顯示出同普通中國倉鼠染色體相同，而 13 個染色體則以“Z”標志，因其中包含著染色體重排、缺失、移位等現(xiàn)象（圖 1.2 左側(cè)框[1]）。此外，染色體異質(zhì)性甚至還表現(xiàn)在了同一個 CHO 細胞系內(nèi)部：比如 CHO-K1 細胞系的祖源細胞系，其中24%細胞群體，被發(fā)現(xiàn)所含有的染色體數(shù)目不是 21 條，比如為 19，20，22 或者 44 條[21]。一項關(guān)于 CHO-K1 細胞系的研究顯示，染色體的“模式”數(shù)目為 20；所謂模式數(shù)目，指的是在不同個體細胞內(nèi)，擁有不同數(shù)目的染色體數(shù)目，而 20 是其中最具有代表性的[22]。此外， CHO-DG44 細胞系內(nèi)同樣也出現(xiàn)了類似 20 條染色體的核型。在DG44 細胞系內(nèi)，有 7 條常規(guī)染色體，4 條“Z”染色體以及 9 條衍生染色體。而在 30%-40%的重組 DG44 細胞系內(nèi)，這種核型依然存在，盡管亞克隆細胞系內(nèi)還存在著染色體重排現(xiàn)象[9]。

圖 1.3 CRISPR/Cas9 工作原理示意圖[36]Fig. 1.3 Schematic diagram of CRISPR/Cas9由于 CRISPR/Cas9 體系的操作簡便性，其在各個領(lǐng)域中均有廣泛的運用。CRIPSR/Cas9 除了直接用于基因編輯，也能夠用于藥物靶點的大規(guī)模篩選。現(xiàn)有的shRNA 文庫篩選主要存在兩個缺點：一是因為 RNAi 不能夠做到完全 knock-down，因此會有很多假陰性；二是 RNAi 脫靶的頻率高，會導致很多的假陽性。而 CRISPRi 技術(shù)可以減少這些干擾。由于 CRISPRi 技術(shù)是基于對目的基因能否轉(zhuǎn)錄進行直接調(diào)控，可直接使目的基因無法轉(zhuǎn)錄；而不是類似于 shRNA 是對已經(jīng)轉(zhuǎn)錄好的 RNA 進行調(diào)控；同時由于 sgRNA 序列一般比較短，可以實現(xiàn)高通量的 array-based 寡核苷酸合成，從而構(gòu)建 sgRNA 文庫。CRISPRi LOF （loss-of-function）文庫與 CRISPRa GOF（gain-of-function）文庫都可以細胞生長為指標，大規(guī)模地分析癌細胞中的遺傳依賴關(guān)系。此外，在加入某藥品的情況下進行篩選，可以分析該藥物產(chǎn)生耐藥性的機制。比如在黑色素瘤細胞系 A375 中進行 BRAF 抑制劑 vemurafenib 的耐藥性篩選發(fā)現(xiàn)，腫瘤抑制因子 NF2，culin E3 連接酶 CUL3 以及一些組蛋白質(zhì)乙酰轉(zhuǎn)移酶 STAGA 復合物

【參考文獻】：
期刊論文
[1]穩(wěn)定表達GLP-1類似物的CHO細胞株的構(gòu)建及培養(yǎng)工藝研究[J]. 張晶晶,劉克東,錢凱,繆亞娜,蔡燕飛,李成媛,陳蘊,金堅.  中國生物工程雜志. 2017(05)
[2]信號肽對肝細胞生長因子HGF在CHO中表達及分泌的影響[J]. 徐棟生,陳蘊,金堅.  中國細胞生物學學報. 2016(12)
[3]基因編輯技術(shù)及其應(yīng)用研究進展[J]. 夏天,林仙花,胡雪峰.  生物學教學. 2016(11)



本文編號：3029094