優(yōu)質(zhì)的微生物菌種對提高發(fā)酵工業(yè)產(chǎn)品的品質(zhì)與產(chǎn)量有重要意義,而高效的育種技術(shù)對微生物選育工作至關(guān)重要�；蚓庉嫾夹g(shù)作為現(xiàn)代遺傳學(xué)研究的熱點(diǎn)技術(shù),極大地提升了現(xiàn)代工業(yè)微生物育種效率�；蚓庉嫾夹g(shù)主要包含鋅指核酸酶技術(shù)（ZFN）、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶技術(shù)（TALEN）和成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列相關(guān)蛋白技術(shù)（CRISPR）3類。ZFN由于技術(shù)的復(fù)雜性,在工業(yè)微生物育種中鮮有報道。TALEN和CRISPR技術(shù)在釀酒酵母、米曲霉菌、黑曲霉、谷氨酸棒狀桿菌和產(chǎn)甘油假絲酵母等主要工業(yè)微生物育種中相繼展開應(yīng)用,尤以CRISPR技術(shù)應(yīng)用最為廣泛。 

【文章來源】：發(fā)酵科技通訊. 2020,49(04)

【文章頁數(shù)】：7 頁

【部分圖文】：

TALE蛋白結(jié)構(gòu)

隨著TALE結(jié)構(gòu)與功能的深入解析,TALEN基因編輯技術(shù)出現(xiàn),并逐步取代ZFN技術(shù)。TALEN復(fù)合物主要包含兩部分:1) 用于識別與定位基因組靶標(biāo)序列的TALE;2) 用于切割基因組靶標(biāo)序列的非特異性核酸內(nèi)切結(jié)構(gòu)域Fok I如圖2(a)所示。Fok I來自海床黃桿菌,為IIS型內(nèi)切酶,該酶只在二聚體狀態(tài)時才有活性,行使靶序列切割功能。Fok I與TALEs的C端相連,由TALEs導(dǎo)向靶標(biāo)序列。為使Fok I具有切割活性,TALEN二聚體需分別附著于雙鏈兩側(cè),且中間預(yù)留出14～20 bp的切割空間如圖2(a)所示[8]。TALEN技術(shù)的工作原理與ZFN近似,首先是由TALE蛋白靶向識別宿主DNA序列,然后Fok I切割目標(biāo)序列,產(chǎn)生雙鏈斷裂(Double-strand breaks,DSBs),激活細(xì)胞內(nèi)源性DNA修復(fù)機(jī)制引入突變。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)存在DSB側(cè)翼序列的同源序列時,引發(fā)同源重組(Homologous recombination,HR)修復(fù),可將外源DNA片段導(dǎo)入宿主目標(biāo)DNA區(qū)域,形成插入突變;反之,細(xì)胞內(nèi)不存在同源序列時,引發(fā)非同源末端連接(Non-homologous end joining,NHEJ)修復(fù),NHEJ修復(fù)易導(dǎo)致DSB側(cè)翼序列接合時發(fā)生核苷酸的缺失、插入或改變,形成無法預(yù)料的位點(diǎn)突變[4-5]如圖2(c)所示。1.2 應(yīng)用進(jìn)展

CRISPR/Cas系統(tǒng)由CRISPR序列和Cas基因序列組成。CRISPR是一段具有前導(dǎo)區(qū)(leader sequence)和重復(fù)-間隔區(qū)(repeat-spacer)的DNA序列如圖3所示[17]。前導(dǎo)區(qū)為一段富含AT的序列,被認(rèn)為是CRISPR簇的啟動子區(qū)。重復(fù)序列(repeats)是一段有回文或發(fā)卡結(jié)構(gòu)的21～48 bp的序列,間隔序列(spacers)是一段特異性序列,其決定了CRISPR/Cas系統(tǒng)的靶向性。Cas基因序列經(jīng)轉(zhuǎn)錄翻譯合成CAS家族蛋白,CAS蛋白具有核酸內(nèi)切酶活性、解旋酶活性和DNA結(jié)合功能域。其核酸酶結(jié)構(gòu)域?yàn)镠NH和RuvC,分別負(fù)責(zé)切斷靶標(biāo)序列的互補(bǔ)鏈與非互補(bǔ)鏈。與TALEN技術(shù)原理不同,CRISPR/Cas系統(tǒng)以轉(zhuǎn)錄得到的crRNA為向?qū)?與CAS蛋白形成CRISPR效應(yīng)核蛋白復(fù)合體(crRNP),crRNP在crRNA的引導(dǎo)下與靶序列結(jié)合,并識別靶序列周邊的原間隔相鄰基序(Protospacer-adjacent motifs,PAM),在NGG-PAM前3～8 bp位置處進(jìn)行切割,產(chǎn)生雙鏈斷裂誘發(fā)宿主細(xì)胞內(nèi)源性HR修復(fù)或NHEJ修復(fù)引入突變見圖2(b,c))[2,18-19]。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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碩士論文
[1]產(chǎn)甘油假絲酵母CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)的構(gòu)建[D]. 朱敏陽.江南大學(xué) 2019
[2]I-B-Svi型CRISPR-Cas系統(tǒng)在谷氨酸棒狀桿菌中的基因編輯[D]. 夏婷婷.安徽大學(xué) 2019
[3]基于TALENs的絲狀真菌基因組精確編輯[D]. 李麗莎.福州大學(xué) 2017



本文編號：3028874