豬塞內(nèi)加谷病毒（Seneca Valley virus,SVV）可引起豬鼻鏡及蹄冠處出現(xiàn)水皰、潰爛創(chuàng)面從而導(dǎo)致跛足甚至死亡,并具有傳染性,對(duì)豬群危害重大。近幾年來(lái),SVV在世界各地頻繁暴發(fā),但由于其臨床癥與口蹄疫等病毒相似而被忽視,因此對(duì)該病毒開展的組織培養(yǎng)特性、病理學(xué)特點(diǎn)以及分子生物學(xué)特性的系統(tǒng)性研究具有重要意義。本研究采集四川眉山和遂寧等地區(qū)疑似SVV感染豬群的水皰液病變組織等原始病料,檢測(cè)后選擇SVV陽(yáng)性病料無(wú)菌處理后接種PK-15細(xì)胞進(jìn)行病毒分離。結(jié)果兩組病料皆在盲傳過(guò)程中使PK-15細(xì)胞出現(xiàn)CPE,傳至10代后,接毒24h穩(wěn)定出現(xiàn)典型CPE,表現(xiàn)為個(gè)別細(xì)胞變圓,并隨著時(shí)間的增加大量細(xì)胞堆積破碎,漂浮于液面上。對(duì)分離的病毒株進(jìn)行挑斑純化,經(jīng)RT-PCR檢測(cè)證實(shí)成功分離出兩株SVV毒株,將其命名為SVV-MS株和SVV-SN株。經(jīng)測(cè)定,SVV-MS株和SVV-SN株的TCID₅₀分別為10^-5.66/0.1 mL and 10^-6.12/0.1 mL。將SVV-SN株分別對(duì)2-3日齡及7-9日齡乳鼠進(jìn)行攻毒,經(jīng)鑒定... 

【文章來(lái)源】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)四川省 211工程院校

【文章頁(yè)數(shù)】：77 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
主要縮略詞
第一章 文章綜述
    1 塞內(nèi)加谷病毒及其發(fā)現(xiàn)
    2 SVV的基因組結(jié)構(gòu)及其功能
        2.1 5'UTR與3'UTR
        2.2 SVV的多蛋白前體
        2.3 SVV的結(jié)構(gòu)蛋白
        2.4 SVV的非結(jié)構(gòu)蛋白
    3 SVV細(xì)胞培養(yǎng)特性
    4 SVV的致病性
        4.1 臨床癥狀
        4.2 解剖癥狀
    5 SVV的流行病學(xué)
    6 SVV的鑒別診斷與預(yù)防
    7 研究目的與意義
第二章 SVV-MS株和SVV-SN株的分離與鑒定
    1 試驗(yàn)材料
        1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
        1.2 主要酶和試劑
        1.3 病料、細(xì)胞與質(zhì)粒
        1.4 主要儀器
        1.5 主要配制試劑
    2 試驗(yàn)方法
        2.1 引物的設(shè)計(jì)與合成
        2.2 病料的處理與RT-PCR檢測(cè)
        2.3 SVV的分離與培養(yǎng)
            2.3.1 細(xì)胞的復(fù)蘇與培養(yǎng)
            2.3.2 SVV的分離與培養(yǎng)
            2.3.3 SVV的蝕斑純化
            2.3.4 病毒TCID50 的測(cè)定
        2.4 乳鼠攻毒實(shí)驗(yàn)
    3 結(jié)果分析
        3.1 病料檢測(cè)結(jié)果
        3.2 SVV的分離與培養(yǎng)
        3.3 RT-PCR檢測(cè)
        3.4 SVV TCID50 的測(cè)定
        3.5 乳鼠攻毒實(shí)驗(yàn)
    4 討論
第三章 SVV-MS株和SVV-SN株全基因測(cè)序與分析
    1 試驗(yàn)材料
        1.1 主要酶及試劑
        1.2 毒株、細(xì)胞及質(zhì)粒
        1.3 主要儀器
        1.4 主要配制試劑
    2 試驗(yàn)方法
        2.1 引物的設(shè)計(jì)與合成
        2.2 SVV的增殖
        2.3 RNA的提取
        2.4 SVV的 c DNA合成
            2.4.1 5'-UTR與3'-UTR的 c DNA合成
            2.4.2 ORF的 c DNA合成
        2.5 SVV基因組的擴(kuò)增
            2.5.1 5'-UTR與3'-UTR的 c DNA擴(kuò)增
            2.5.2 ORF的 c DNA的擴(kuò)增
        2.6 目的片段的回收
        2.7 重組質(zhì)粒的構(gòu)建
            2.7.1 目的基因與質(zhì)粒的連接
            2.7.2 感受態(tài)細(xì)胞的制備
            2.7.3 轉(zhuǎn)化
        2.8 全基因組序列分析
    3 結(jié)果分析
        3.1 全基因的分段擴(kuò)增與克隆
        3.2 全基因組的序列拼接
        3.3 全基因序列特征及與遺傳進(jìn)化樹分析
            3.3.1 全基因序列同源性分析
            3.3.2 全基因遺傳進(jìn)化樹分析
            3.3.3 VP1 基因序列同源性分析
            3.3.4 VP1 基因遺傳進(jìn)化樹分析
            3.3.5 VP1 基因氨基酸序列分析
    4 討論
第四章 SVV-3C基因真核質(zhì)粒的構(gòu)建表達(dá)
    1 試驗(yàn)材料
        1.1 主要酶及試劑
        1.2 質(zhì)粒、菌種、細(xì)胞和毒株
        1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器
        1.4 主要配制試劑
    2 試驗(yàn)方法
        2.1 SVV3C蛋白序列的擴(kuò)增
            2.1.1 設(shè)計(jì)擴(kuò)增SVV3C蛋白的引物
            2.1.2 擴(kuò)增SVV3C蛋白序列
            2.1.3 目的片段回收
            2.1.4 回收后目的片段與pMD19-T載體重組質(zhì)粒的構(gòu)建
            2.1.5 質(zhì)粒抽提
        2.2 SVV3C蛋白的生物信息學(xué)分析
        2.3 SVV3C蛋白真核質(zhì)粒的構(gòu)建
            2.3.1 載體及目的片段的酶切和回收
            2.3.2 3C序列與表達(dá)載體pcDNA3.1（+）的連接
            2.3.3 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化
            2.3.4 重組質(zhì)粒鑒定
                2.3.4.1 重組質(zhì)粒PCR鑒定
                2.3.4.2 重組質(zhì)粒雙酶切鑒定
                2.3.4.3 真核表達(dá)重組質(zhì)粒的序列測(cè)定
        2.4 SVV3C蛋白真核質(zhì)粒的表達(dá)
            2.4.1 質(zhì)粒抽提（無(wú)內(nèi)毒素）
            2.4.2 轉(zhuǎn)染
            2.4.3 樣品制備
            2.4.4 SDS-PAGE電泳
            2.4.5 免疫印跡
        2.5 SVV3C蛋白對(duì)帽樣結(jié)構(gòu)依賴蛋白的影響
            2.5.1 pcDNA3.1（+）-SVV-3C和 pEGFP-N1 的共轉(zhuǎn)染
            2.5.2 觀察及免疫印跡法驗(yàn)證
    3 結(jié)果分析
        3.1 SVV3C蛋白序列的擴(kuò)增
        3.2 SVV3C蛋白生物信息學(xué)分析
            3.2.1 SVV3C基因結(jié)構(gòu)分析
            3.2.2 二級(jí)結(jié)構(gòu)分析
            3.2.3 SVV3C蛋白真核質(zhì)粒的構(gòu)建
        3.3 SVV3C蛋白真核質(zhì)粒的表達(dá)
        3.4 SVV3C蛋白對(duì)帽樣結(jié)構(gòu)依賴蛋白的影響
            3.4.1 熒光顯微鏡觀察
            3.4.2 免疫印跡法驗(yàn)證
    4 討論
全文總結(jié)
參考文獻(xiàn)
致謝
作者簡(jiǎn)歷
    一、個(gè)人基本情況
    二、教育經(jīng)歷
    三、攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文



本文編號(hào)：3026562