半胱氨酸蛋白酶抑制劑,也稱為胱抑素,在各種生物中廣泛存在著,其能夠抑制活性中心中含有半胱氨酸（cySH）殘基的半胱氨酸蛋白酶。與半胱氨酸蛋白酶抑制劑C相比,半胱氨酸蛋白酶抑制劑F抑制半胱氨酸蛋白酶的機制很少報道。在本研究中,首先構(gòu)建重組質(zhì)粒pPIC9K-CST7,之后將其導(dǎo)入進巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris）GS115中。經(jīng)甲醇誘導(dǎo)表達及組氨酸標(biāo)簽純化最終獲得一種具有活性的重組半胱氨酸蛋白酶抑制劑F。測量重組胱抑素F的抑制活性,并計算IC50為4.78μM。利用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)分析法對抑制類型進行分析,發(fā)現(xiàn)在添加不同重組胱抑素F濃度的蛋白酶水解反應(yīng)中,未觀察到Vmax的明顯變化,而Km值隨抑制劑濃度的增加而增加,胱抑素F的抑制類型為與蛋白酶底物的競爭性抑制。等溫滴定量熱分析顯示出其與木瓜蛋白酶的結(jié)合能力（Kd=9.387×10-7M）,根據(jù)化學(xué)計量比顯示重組半胱氨酸蛋白酶抑制劑F與木瓜蛋白酶相結(jié)合的比例為1:1。在胱抑素F和木瓜蛋白酶的結(jié)合過程中,β-折疊的二級結(jié)構(gòu)顯著增加,無規(guī)則卷曲的百分比減少,熒光強度在逐漸降低。結(jié)合木瓜蛋白酶晶體結(jié)構(gòu)（PDB ... 

【文章來源】：大連工業(yè)大學(xué)遼寧省

【文章頁數(shù)】：71 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

重組質(zhì)粒構(gòu)建示意圖

第二章Cystatin基因在酵母中的重組表達242.3結(jié)果與討論2.3.1CST7基因的獲得與重組質(zhì)粒的構(gòu)建2.3.1.1CST7基因的獲得從豬的肝臟組織中提取RNA時，肝臟組織的新鮮程度影響著RNA的提取效果，如圖2.1所示當(dāng)RNA的瓊脂糖電泳圖達到28s，18s以及5s三條條帶清晰不拖尾或者僅有少量的拖尾現(xiàn)象，根據(jù)實驗結(jié)果選取Abs260/280的數(shù)值為2.04的樣本，濃度為1228ng/μL，用作下一步反轉(zhuǎn)錄實驗使用。圖2.2豬總RNA提取瓊脂糖電泳圖Figure2.2AgarosegelelectrophoresisforthepigTotalRNA將提取得到的豬的總RNA，經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄實驗得到cDNA序列，根據(jù)NCBI網(wǎng)站上半胱氨酸蛋白酶抑制劑基因CST7基因序列（GeneID:100152012）所設(shè)計的引物SsCyt-F和SsCyt-R，經(jīng)過PCR反應(yīng)得到帶有酶切位點的CST7基因，如圖2.1所示，CST7基因總長為441bp加上引物長度43bp條帶總長484bp。2.3.1.2重組質(zhì)粒的驗證按照2.2.4.1所述方法，將pPIC9K質(zhì)粒與目的基因CST7相連接組成重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌中，導(dǎo)入成功的大腸桿菌可以在篩選培養(yǎng)基上生長。挑取菌落在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)成菌液，使用通用引物GAL/CYC對導(dǎo)入重組質(zhì)粒的大腸桿菌菌液進行PCR驗證。

第二章Cystatin基因在酵母中的重組表達25由pPIC9K全序列可知，在導(dǎo)入目的基因后的質(zhì)粒使用通用引物PCR驗證基因片段結(jié)果為624bp，如圖2.3所示。圖2.3CST7基因擴增產(chǎn)物的瓊脂糖電泳圖Figure2.3AgarosegelelectrophoresisfortheamplificationproductofCST7gene圖2.4重組質(zhì)粒pPIC9K-CST7的菌液PCR驗證Figure2.4AgarosegelelectrophoresisfortherecombinantplasmidpPIC9K-CST7bacterialfluidPCRverification

【參考文獻】：
期刊論文
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碩士論文
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本文編號：3016217