目的為修復(fù)石骨癥致病基因（CLCN7）進(jìn)行前期探索,采用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建CLCN7基因編輯表達(dá)載體。方法根據(jù)sgRNA設(shè)計(jì)原則,在CLCN7外顯子區(qū)設(shè)計(jì)一對(duì)sgRNA,合成四條單鏈DNA寡核苷酸,退火后連接于CRISPR/Cas9質(zhì)粒的BspQ I酶切位點(diǎn)處,然后轉(zhuǎn)染感受態(tài)大腸桿菌DH5α,并通過氨芐青霉素抗性篩選陽性克隆,擴(kuò)大培養(yǎng)。結(jié)果最后經(jīng)過PCR和Sanger測序鑒定獲得了兩個(gè)基因編輯表達(dá)載體CLCN7-sg1RNA-CRISPR-Cas9和CLCN7-sg2RNACRISPR-Cas9。結(jié)論基因編輯載體的成功構(gòu)建為CLCN7突變修復(fù)提供了工作基礎(chǔ)。 

【文章來源】：實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué). 2020,38(03)

【文章頁數(shù)】：4 頁

【部分圖文】：

CRISPR/Cas9質(zhì)粒圖譜

在重組質(zhì)粒CLCN7-sg1RNA-CRISPR/Cas9和CLCN7-sg2RNA-CRISPR/Cas9的構(gòu)建過程中,分別將線性化載體與寡核苷酸使用T4連接酶連接,并轉(zhuǎn)化至TOP10細(xì)胞中，并分別挑取8個(gè)克隆，擴(kuò)培后提取質(zhì)粒，使用DNA引物CC-CX-F和CC-CX-R進(jìn)行PCR分析,見表1與圖4,結(jié)果表明除了重組質(zhì)粒CLCN7-sg1RNA-CRISPR/Cas9的6號(hào)克隆和CLCN7-sg2RNA-CRISPR/Cas9的16號(hào)克隆外均為陽性克隆；最后，選取陽性克隆進(jìn)行Sanger測序，結(jié)果顯示陽性克隆成果插入了目的序列sg1RNA和sg2R NA，堿基序列與預(yù)期一致,見圖5和圖6，證實(shí)重組質(zhì)粒CLCN7-sg1RNA-CRISPR/Cas9和CLCN7-sg2RNA-CRISPR/Cas9已構(gòu)建成功。圖5 重組質(zhì)粒CLCN7-sg1RNA-CRISPR/Cas9的測序結(jié)果

重組質(zhì)粒CLCN7-sg1RNA-CRISPR/Cas9的測序結(jié)果

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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本文編號(hào)：3015061