目的為修復石骨癥致病基因（CLCN7）進行前期探索,采用CRISPR/Cas9技術構建CLCN7基因編輯表達載體。方法根據sgRNA設計原則,在CLCN7外顯子區(qū)設計一對sgRNA,合成四條單鏈DNA寡核苷酸,退火后連接于CRISPR/Cas9質粒的BspQ I酶切位點處,然后轉染感受態(tài)大腸桿菌DH5α,并通過氨芐青霉素抗性篩選陽性克隆,擴大培養(yǎng)。結果最后經過PCR和Sanger測序鑒定獲得了兩個基因編輯表達載體CLCN7-sg1RNA-CRISPR-Cas9和CLCN7-sg2RNACRISPR-Cas9。結論基因編輯載體的成功構建為CLCN7突變修復提供了工作基礎。 

【文章來源】：實驗與檢驗醫(yī)學. 2020,38(03)

【文章頁數(shù)】：4 頁

【部分圖文】：

CRISPR/Cas9質粒圖譜

在重組質粒CLCN7-sg1RNA-CRISPR/Cas9和CLCN7-sg2RNA-CRISPR/Cas9的構建過程中,分別將線性化載體與寡核苷酸使用T4連接酶連接,并轉化至TOP10細胞中，并分別挑取8個克隆，擴培后提取質粒，使用DNA引物CC-CX-F和CC-CX-R進行PCR分析,見表1與圖4,結果表明除了重組質粒CLCN7-sg1RNA-CRISPR/Cas9的6號克隆和CLCN7-sg2RNA-CRISPR/Cas9的16號克隆外均為陽性克隆；最后，選取陽性克隆進行Sanger測序，結果顯示陽性克隆成果插入了目的序列sg1RNA和sg2R NA，堿基序列與預期一致,見圖5和圖6，證實重組質粒CLCN7-sg1RNA-CRISPR/Cas9和CLCN7-sg2RNA-CRISPR/Cas9已構建成功。圖5 重組質粒CLCN7-sg1RNA-CRISPR/Cas9的測序結果

重組質粒CLCN7-sg1RNA-CRISPR/Cas9的測序結果

【參考文獻】：
期刊論文
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本文編號：3015061