蘋(píng)果是典型的呼吸躍變型果實(shí),在其生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中,乙烯起了至關(guān)重要的作用。ERF家族轉(zhuǎn)錄因子屬于乙烯信號(hào)通路中直接對(duì)靶基因起作用的關(guān)鍵因子,而MdERF2基因是乙烯調(diào)控蘋(píng)果果實(shí)發(fā)育與品質(zhì)的重要的轉(zhuǎn)錄因子,但目前對(duì)于乙烯調(diào)控MdERF2的機(jī)理及效果仍然不能確定,本文分析了MdERF2基因啟動(dòng)子序列特性,并利用含β-葡萄糖苷酸酶（GUS）和綠色熒光蛋白（GFP）的瞬時(shí)表達(dá)載體,雙重研究和驗(yàn)證了乙烯及其抑制劑1-MCP對(duì)MdERF2基因啟動(dòng)子的調(diào)控模式,主要結(jié)果如下:采用PCR技術(shù)擴(kuò)增MdERF2基因啟動(dòng)子,序列分析表明,擴(kuò)增獲得的啟動(dòng)子全長(zhǎng)為1348 bp。利用Plant CARE和PLACE數(shù)據(jù)庫(kù)分析基因啟動(dòng)子中所含有的順式作用元件,發(fā)現(xiàn)具有TATA框和CAAT框等基礎(chǔ)元件,還具有GARE-motif、CCAAT-box、Box4、GT1-motif和MBS等其它元件。構(gòu)建pRI-ProMdERF2-GUS啟動(dòng)子瞬時(shí)表達(dá)載體,采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法瞬時(shí)轉(zhuǎn)化番茄果實(shí)和葉片來(lái)驗(yàn)證啟動(dòng)子的活性。結(jié)果表明:由Pro MdERF2驅(qū)動(dòng)的GUS基因,在1-MCP、乙烯利以及空白的三種處理下,番茄果實(shí)和葉片均... 

【文章來(lái)源】：山東理工大學(xué)山東省

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

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新紅星蘋(píng)果基因組DNA的提取結(jié)果

山東理工大學(xué)碩士學(xué)位論文第二章蘋(píng)果MdERF2啟動(dòng)子擴(kuò)增與瞬時(shí)表達(dá)載體的構(gòu)建212.3.2MdERF2基因啟動(dòng)子的PCR擴(kuò)增以ERF2-F/ERF2-R為擴(kuò)增引物，提取的新紅星蘋(píng)果基因組DNA為模板擴(kuò)增MdERF2基因啟動(dòng)子序列，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，擴(kuò)增出一條約1300bp左右的條帶（圖2.2），擴(kuò)增出的特異性產(chǎn)物大小均與預(yù)期PCR產(chǎn)物大小一致。圖2.2MdERF2基因啟動(dòng)子PCR產(chǎn)物Fig.2.2PCRproductofMdERF2genepromoter注：M：DL2000Marker；1-6：MdERF2基因啟動(dòng)子PCR產(chǎn)物2.3.3啟動(dòng)子序列測(cè)序及序列分析將PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物送至上海生工生物工程（濟(jì)南）有限公司測(cè)序，序列采用在線軟件預(yù)測(cè)其中的順式作用元件，結(jié)果見(jiàn)圖2.3。結(jié)果顯示，PCR擴(kuò)增所獲得的啟動(dòng)子長(zhǎng)度為1348bp，同源比對(duì)結(jié)果顯示與NCBI上蘋(píng)果MdERF2基因啟動(dòng)子序列的同源性達(dá)到99%，將該啟動(dòng)子命名為ProMdERF2。表2.9核心啟動(dòng)子區(qū)域預(yù)測(cè)Tab.2.9Predictionofcorepromoter起始位點(diǎn)結(jié)束位點(diǎn)得分核心啟動(dòng)子區(qū)-581-5300.99TCAGTGTGCATATAGAAACCGTGCAGCCCCAACGGCACACGTGACAGAAG-41+100.99CCTGACTTCTATATATACCCCTAGATACCTTCTCTTCCACAATTCGTGAA采用BerkeleyDrosophilaGenomeProject數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)ProMdERF2序列中所含的核心區(qū)域進(jìn)行預(yù)測(cè)，預(yù)測(cè)結(jié)果表明該序列中含兩處核心啟動(dòng)子區(qū)域，結(jié)果見(jiàn)表2.9。使用Softberry

山東理工大學(xué)碩士學(xué)位論文第二章蘋(píng)果MdERF2啟動(dòng)子擴(kuò)增與瞬時(shí)表達(dá)載體的構(gòu)建26表2.14MatrixCatch2.7軟件預(yù)測(cè)結(jié)果Tab.2.14ForecastresultsfromMatrixCatch2.7softwareFactornameP-ValueSequenceCREBP1CJUN1.051e-02TGACTTTGCAATTTCCATTCHNF31.720e-02GTTGTATATCCTAGttgtaacttgtaagtgtgtcaATAAAAAAATAAAHNF33.518e-02TCAGTTTGACAACGcatgctgagagtaactacagataAAAACTAAACATGNFKBHMGIY1.963e-02AGGCAGAAAATT2.3.5pRI-ProMdERF2-GFP表達(dá)載體的構(gòu)建用HindIII和XbaI雙酶切MdERF2啟動(dòng)子片段，同時(shí)用HindIII和XbaI雙酶切pRI-101-GFP載體，分別回收線性化的pRI-101-GFP載體（圖2.4a）和啟動(dòng)子片段（圖2.4b）。經(jīng)HindIII和XbaI雙酶切獲得的MdERF2啟動(dòng)子與經(jīng)相同限制性核酸內(nèi)切酶雙酶切獲得的線性化載體，用T4-DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布含50mg/LKan的LB固體培養(yǎng)基篩選培養(yǎng)。圖2.4pRI-101-GFP載體及MdERF2啟動(dòng)子片段用HindIII和XbaI雙酶切回收電泳圖Fig.2.4RecoveryelectrophoresisofpRI-101-GFPvectorandpromoterfragmentsbydigestwithHindIIIandXbaI注：a：pRI-101-GFP載體酶切回收?qǐng)D（M：DL15000Marker；1：pRI-101-GFP載體用HindIII和XbaI雙酶切回收?qǐng)D）；b：ERF2啟動(dòng)子酶切回收?qǐng)D（M：DL2000Marker；1：MdERF2啟動(dòng)子用HindIII和XbaI雙酶切回收?qǐng)D）


本文編號(hào)：3009621