發(fā)布時(shí)間：2021-01-30 22:18

　　2020年,諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)授予現(xiàn)就職于德國(guó)馬普感染生物學(xué)研究所的法籍科學(xué)家Emmanuelle Charpentier和美國(guó)加州大學(xué)伯克利分校的Jennifer Doudna,表彰她們發(fā)明CRISPR基因編輯方法.她們揭示了Cas9具有RNA介導(dǎo)的DNA核酸內(nèi)切酶活性,可以切斷任意DNA雙鏈,產(chǎn)生雙鏈斷裂.她們指出CRISPR具有在活細(xì)胞中修改基因的作用,利用CRISPR-Cas9編輯工具,可以精確改變細(xì)胞中的DNA.由于簡(jiǎn)單、高效、廉價(jià)等特征,CRISPR已經(jīng)成為最為流行的基因編輯技術(shù),被稱(chēng)為基因編輯"魔剪".本文介紹了兩位諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)得主的研究成果,概述了CRISPR系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)歷程,以及CRISPR-Cas9的功能和應(yīng)用. 

【文章來(lái)源】：生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展. 2020,47(11)北大核心

【文章頁(yè)數(shù)】：8 頁(yè)

【部分圖文】：

CRISPR-Cas領(lǐng)域關(guān)鍵研究成果

更多的基因組測(cè)序結(jié)果和生物信息學(xué)分析表明超過(guò)90%的古細(xì)菌和約50%的細(xì)菌中都有CRISPR-Cas系統(tǒng).典型的CRISPR序列是由一段引導(dǎo)序列（leader）開(kāi)始，引導(dǎo)序列中含有轉(zhuǎn)錄CRISPR序列所需的啟動(dòng)子.在引導(dǎo)序列之后是多個(gè)高度重復(fù)序列（repeat）和將這些重復(fù)序列隔開(kāi)的長(zhǎng)短不一的間隔序列（spacer）（圖2).CRISPR序列中repeat序列具有種屬特異性，而spacer序列與某些病毒或質(zhì)粒的序列同源[17-18]，表明這些spacer序列可能來(lái)自外源入侵的核酸.2 CRISPR是原核生物體內(nèi)的獲得性免疫系統(tǒng)

Cas9的HNH和Ruv C核酸酶結(jié)構(gòu)域分別負(fù)責(zé)切割ds DNA的TS鏈和NTS (non-target strand）鏈.突變HNH活性位點(diǎn)，TS鏈切割受到抑制，而NTS鏈的切割因Ruv C的突變而受到抑制.結(jié)構(gòu)生物學(xué)的發(fā)現(xiàn)解釋了Cas9兩種核酸酶結(jié)構(gòu)域分別切割ds DNA兩條鏈的分子機(jī)制.Cas9由NUC lobe和REC lobe組成二裂片的結(jié)構(gòu)，含多個(gè)正電荷氨基酸富集的核酸結(jié)合通道.在Cas9-sg RNA-DNA的結(jié)構(gòu)中，可以觀察到sg RNA與DNA形成一個(gè)“R-loop”的結(jié)構(gòu).cr RNA與TS互補(bǔ)配對(duì)，形成cr RNA∶TS雜合雙鏈體.結(jié)合在REC lobe和NUC lobe形成的中間通道內(nèi)，HNH結(jié)構(gòu)域在雜合雙鏈中TS上的切割位點(diǎn)附近對(duì)其進(jìn)行切割，而NTS沿著另一條位于NUC lobe的核酸結(jié)構(gòu)通道伸入Ruv C結(jié)構(gòu)域的活性口袋附近被切割（圖3).PAM序列對(duì)于Cas9識(shí)別和切割靶標(biāo)DNA至關(guān)重要.Charpentier與Doudna驗(yàn)證ds DNA protospacer附近的序列對(duì)DNA結(jié)合和切割的影響，發(fā)現(xiàn)protospacer下游5′-NGG-3′PAM序列是Spy Cas9識(shí)別DNA的必要條件.當(dāng)突變PAM序列，Spy Cas9結(jié)合ds DNA的親和力大幅度減弱，切割DNA的活性也隨之降低.Cas9的C端含有PI結(jié)構(gòu)域，它特異性讀取位于NTS上的PAM序列，這影響ds DNA的穩(wěn)定性促使其解鏈，并促進(jìn)向?qū)NA與互補(bǔ)DNA雜合形成R-loop結(jié)構(gòu).通過(guò)PI結(jié)構(gòu)域氨基酸與PAM位點(diǎn)核苷酸堿基的特異性相互作用，不同的Cas9識(shí)別不同類(lèi)型的PAM序列.CRISPR位點(diǎn)的spacer附近無(wú)PAM序列，而外源核酸protospacer附近含PAM特征序列，因此PAM序列的識(shí)別是CRISPR-Cas9區(qū)分“自我”和“非我”的關(guān)鍵因素.Cas9通過(guò)PAM區(qū)分自身與異己ds DNA,cr RNA∶TS互補(bǔ)配對(duì)形成R-loop，實(shí)現(xiàn)對(duì)靶DNA的精準(zhǔn)切割，為基因編輯提供可靠的剪刀.基于Cas9的結(jié)構(gòu)，還可對(duì)PI結(jié)構(gòu)域與ds DNA結(jié)合的氨基酸進(jìn)行改造，識(shí)別不同的PAM序列，擴(kuò)大基因編輯工具包[30].

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]Crystal structure of Cas1 in complex with branched DNA[J]. Jing Yang,Jiazhi Li,Jiuyu Wang,Gang Sheng,Min Wang,Hongtu Zhao,Yanhua Yang,Yanli Wang.  Science China（Life Sciences）. 2020(04)



本文編號(hào)：3009684