【目的】木霉屬真菌是應(yīng)用最為廣泛和潛力最大的生防真菌,其產(chǎn)生的典型化合物哌珀霉素（peptaibols）類抗生素在生物防治中發(fā)揮重要作用。本研究采用基因組挖掘技術(shù)（genome mining）發(fā)現(xiàn)炭團木霉（Trichoderma hypoxylon）的潛在哌珀霉素生物合成基因簇及對病原菌的防治作用。【方法】生物信息學(xué)分析預(yù)測合成哌珀霉素的基因簇,利用Quick-change技術(shù)構(gòu)建基因骨架敲除盒,通過PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法獲得敲除突變株,通過平板對峙法和菌絲生長毒力實驗驗證該基因簇對炭團木霉生物活性的影響。【結(jié)果】基因挖掘鑒定一個非核糖體多肽合成酶（nonribosomal peptide synthetases,NRPS）可能合成哌珀霉素類抗生素,命名為NRPS1,對該基因進(jìn)行部分敲除,成功獲得3株NRPS1缺失突變株。對峙實驗表明,突變株對寄生曲霉（Aspergillus parasiticus）、尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）、黑白輪枝菌（Verticillium alboatrum）等9株植物病原真菌的抑制作用與野生株相比顯著下降,且突變株的粗提物的抑... 

【文章來源】：微生物學(xué)報. 2020,60(10)北大核心

【文章頁數(shù)】：12 頁

【部分圖文】：

炭團木霉中NRPS1基因簇生物信息學(xué)分析

哌珀霉素是一類主要由木霉屬真菌產(chǎn)生的典型活性化合物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)具有典型的特征，即N端富含非天然氨基酸α-氨基異丁酸(α-aminoisobutyric acid,Aib),C末端會常常被羥基化成氨基醇(alcohol)的肽(peptide)類抗生素[14–16]。哌珀霉素的主要長度在5–20個氨基酸之間，多數(shù)含有15–20個氨基酸殘基[17–18]。迄今為止，已鑒定的哌珀霉素類化合物超過300個[19]，隨著越來越多的哌珀霉素被發(fā)現(xiàn)，這類特殊化合物的生物合成和功能研究也逐漸成為焦點。2002年，Wiest等從綠木霉(T.virens)中鑒定并克隆了第一個哌珀霉素合成酶基因tex1，該基因由18個完整的最小模塊(A-T-C,adenylation-thiolation-condensation，腺苷酰化結(jié)構(gòu)域-巰基化結(jié)構(gòu)域-縮合結(jié)構(gòu)域)組成，每個模塊序列之間的同源性達(dá)到35%–58%[20]。其中腺苷�；Y(jié)構(gòu)域(adenylation,A-domain)的差異決定了對底物的選擇性不同，進(jìn)而導(dǎo)致化合物結(jié)構(gòu)多樣性，也決定了該類化合物對革蘭氏陽性菌、陰性菌、真菌、螺原體和病毒等活性的不同[13–14]。哌珀霉素抗菌的作用機制是復(fù)雜的，目前的研究主要集中于其穿膜時三維構(gòu)象的差異，其作用機制主要有“桶-板”模型(barrel-stave model)、“毯式”模型(carpet model)、“蟲孔”模型(toroidal pore model)等。最廣為接受的機制是Ehrenstein等在1977年提出的“桶-板”模型，認(rèn)為哌珀霉素以多聚體的形式插入細(xì)胞膜雙分子層，形成跨膜的離子通道，破壞細(xì)胞膜的完整性，干擾細(xì)胞正常的代謝，從而導(dǎo)致細(xì)胞的死亡而達(dá)到殺菌的目的[15,21]。哌珀霉素區(qū)別于其他抗生素的作用機制使其具有廣譜的抗微生物活性，且不易使病原微生物產(chǎn)生抗藥性。本研究中使用的炭團木霉菌株是2016年從Hypoxylon anthochroum中分離得到的[6]，在前期的工作中已建立了該菌高效的遺傳操作體系[22]。鑒于其豐富的次級代謝產(chǎn)物，對其生物學(xué)功能的研究具有重要理論意義。通過基因挖掘策略，對炭團木霉基因組進(jìn)行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)了一個含有19個A-T-C模塊的NRPS1，且該序列在不同木霉中均保守。通過與已知哌珀霉素的生物合成基因進(jìn)行序列比對，預(yù)測NRPS1可能是合成哌珀霉素類化合物的核心基因。通過PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法獲得NRPS1缺失株，并研究了炭團木霉野生型與突變株的活性差異。證明了該基因在炭團木霉生防過程中發(fā)揮重要作用，為該菌的后續(xù)研究提供了方向，為其生防應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

圖2.炭團木霉中NRPS1基因簇生物信息學(xué)分析將炭團木霉WT和TYHL3在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d，用乙酸乙酯萃取菌絲及培養(yǎng)基，利用高效液相色譜法(HPLC)分析對次級代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析，分析結(jié)果如圖3-C所示。在210 nm波長下，野生型中保留時間為20.2 min的代謝產(chǎn)物峰在NRPS1基因缺失后消失，推測該峰為炭團木霉哌珀霉素類化合物的代謝產(chǎn)物峰，NRPS1基因為哌珀霉素類化合物的生物合成基因。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]后基因組時代的真菌天然產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)[J]. 李偉,吳廣畏,楊玉萍,尹文兵.  菌物學(xué)報. 2015(05)
[2]木霉屬研究概況[J]. 朱兆香,莊文穎.  菌物學(xué)報. 2014(06)
[3]木霉peptaibols抗菌肽的研究進(jìn)展[J]. 宋曉妍,張玉忠,王元秀.  微生物學(xué)報. 2011(04)



本文編號：2986402