目的 :構(gòu)建白念珠菌HOF1基因高表達(dá)菌株,探索HOF1基因高表達(dá)對(duì)細(xì)胞應(yīng)答遺傳毒性試劑脅迫和調(diào)控形態(tài)發(fā)生的作用。方法:采用瞬時(shí)CRISPR/Cas9系統(tǒng),分別于體外擴(kuò)增Cas9基因、單鏈向?qū)NA（single-guide RNA,sgRNA）以及帶MET3啟動(dòng)子的修復(fù)DNA（repair DNA）片段,轉(zhuǎn)化白念珠菌野生型菌株SN148,于SD-Ura-Met-Cys選擇培養(yǎng)基篩選轉(zhuǎn)化子,通過菌落聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction, PCR）驗(yàn)證基因型,以構(gòu)建HOF1基因高表達(dá)菌株;利用平板表型實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HOF1高表達(dá)對(duì)遺傳毒性試劑脅迫的表型,通過4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（4′,6-diamidino-2-phenylindole, DAPI）染色結(jié)合熒光顯微鏡等觀察細(xì)胞形態(tài)。結(jié)果 :PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)HOF1基因自身啟動(dòng)子被MET3啟動(dòng)子成功替換后,通過檢測(cè)引物能擴(kuò)增出約3.2 kb的單一條帶;HOF1基因高表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)遺傳毒性試劑甲基磺酸甲酯（methyl methanesulfonate, MMS）和羥基脲（hydroxyurea, HU）敏感... 

【文章來源】：南通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版). 2020,40(05)

【文章頁數(shù)】：5 頁

【部分圖文】：

HOF1高表達(dá)菌株的構(gòu)建

前期研究[5]發(fā)現(xiàn)，HOF1主要參與胞質(zhì)分裂過程，但其缺失導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)遺傳毒性試劑MMS等敏感。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步檢測(cè)了HOF1高表達(dá)對(duì)細(xì)胞應(yīng)答遺傳毒性試劑的影響：發(fā)現(xiàn)HOF1高表達(dá)也導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)0.01%MMS和30 mmol/L HU表現(xiàn)出一定的敏感性表型(圖2)，預(yù)示HOF1基因在DNA損傷應(yīng)答中發(fā)揮關(guān)鍵作用。此外還發(fā)現(xiàn)，HOF1高表達(dá)不明顯影響細(xì)胞對(duì)紫外線(ultraviolet,UV)脅迫(90 J/m2)的應(yīng)答表型。2.3 HOF1高表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞分裂

本研究主要通過CRISPR/Cas9方法構(gòu)建了HOF1的高表達(dá)菌株。白念珠菌為雙倍體細(xì)胞，其遺傳操作相對(duì)困難，使用傳統(tǒng)方法需要利用兩個(gè)不同的篩選標(biāo)記對(duì)兩個(gè)等位基因依次替換/編輯，過程費(fèi)時(shí)且成功率較低，嚴(yán)重阻礙了白念珠菌基因功能研究的開展。隨著CRIPSR/Cas9系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)以及在白念珠菌中的應(yīng)用，大大提高了基因編輯的效率[10]。而且，本研究中采用了近期新發(fā)明的瞬時(shí)CRISPR/Cas9系統(tǒng)[11]，該系統(tǒng)通過體外PCR擴(kuò)增基因編輯所涉及的Cas9和sg RNA等組分，免去了基因的克隆等步驟，進(jìn)一步簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)流程，如本研究中通過一次轉(zhuǎn)化得到的純合子高表達(dá)菌株比例超過40%，值得大力推廣使用。DNA損傷應(yīng)答與白念珠菌形態(tài)發(fā)生的聯(lián)系是白念珠菌形態(tài)轉(zhuǎn)換研究的一個(gè)新熱點(diǎn)。本課題組前期研究[5]發(fā)現(xiàn)，HOF1參與檢驗(yàn)點(diǎn)激酶Rad53相關(guān)的DNA損傷應(yīng)答，但其具體機(jī)制尚不明了。推測(cè)Hof1可作為一種直接的DNA損傷應(yīng)答調(diào)控相關(guān)蛋白，因其缺失影響了Rad53相關(guān)的損傷應(yīng)答信號(hào)傳遞以及DNA損傷的修復(fù)，導(dǎo)致對(duì)MMS等遺傳毒性試劑敏感；此外，Hof1也可能間接地參與DNA損傷應(yīng)答，其缺失導(dǎo)致胞質(zhì)分裂過程缺陷，進(jìn)而影響了基因組的穩(wěn)定性，表現(xiàn)為對(duì)遺傳毒性試劑敏感。本研究通過構(gòu)建HOF1高表達(dá)菌株，發(fā)現(xiàn)HOF1的高表達(dá)可以促進(jìn)胞質(zhì)分裂，且有較多體積較小細(xì)胞出現(xiàn)，提示細(xì)胞的非正常分裂最終可能影響細(xì)胞對(duì)遺傳毒性試劑的應(yīng)答。綜合前期的研究成果，推測(cè)HOF1可能主要間接參與DNA損傷應(yīng)答，其缺失或高表達(dá)都影響了細(xì)胞周期的正常進(jìn)程，進(jìn)而影響細(xì)胞對(duì)遺傳毒性試劑正確應(yīng)答。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)快速構(gòu)建白念珠菌RAD23高表達(dá)菌株的研究[J]. 馮佳,胡婧,單愛迪,曹振宇,呂睿,馮金榮.  中國病原生物學(xué)雜志. 2019(09)



本文編號(hào)：2985344