半胱氨酸組織蛋白酶cathepsin B主要存在于溶酶體中,是一種嗜酸性蛋白酶,能夠水解胞內(nèi)破損細(xì)胞器和蛋白質(zhì)等,并且能夠隨小泡分泌到細(xì)胞外降解胞外基質(zhì)中組分。斑馬魚中cathepsinb基因存在兩種基因亞型,cathepsinba（ctsba）和 cathepsin bb（ctsbb）。本論文利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除了斑馬魚cathepsinba基因,并在子一代篩選獲得cathepsinba雜合突變體。通過ctsbba雜合突變體互交獲得子二代,部分胚胎在50%下包期胚胎發(fā)育出現(xiàn)停滯,其中一部分死亡,死亡數(shù)占全部胚胎的6.9%左右。另一部分胚胎在停滯約1-2h后恢復(fù)遲緩的發(fā)育,在咽囔期出現(xiàn)明顯的形態(tài)畸形,包括心包囊腫、尾部折疊和彎曲等,發(fā)育至2-3天后死亡,這部分胚胎占全部胚胎數(shù)量的19.3%,經(jīng)基因鑒定結(jié)果顯示這些死亡胚胎均為純合突變體。胚胎死亡率大概占全部胚胎數(shù)量的四分之一,符合孟德爾遺傳定律,說明ctsba基因存在隱性致死效應(yīng)。RT-PCR檢測ctsba-/-突變體中發(fā)生非編碼的mRNA降解（nonsense-mediatedmRNAdecay,NMD）,說明ctssa... 

【文章來源】：山東大學(xué)山東省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：72 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖１．哺乳動物體內(nèi)半胱氨酸組織蛋白酶形成與運輸路線圖［１３］??溶酶體半胱氨酸組織蛋白酶作為溶酶體酶中重要蛋白酶之一，在細(xì)胞內(nèi)外參??

均具有的肽鏈端解酶活性之外，同時也具有肽鏈內(nèi)切酶活性［５］。Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ?Ｂ在??人體中的蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)圖示首先被破解，組織蛋白酶Ｂ作為一個單體蛋白其??結(jié)構(gòu)如圖２所示［３０］。人體中組織蛋白酶Ｂ前體蛋白其蛋白結(jié)構(gòu)包括３３９個氨基??酸：Ｎ末端為１７個氨基酸殘基及其后連接６２個氨基酸殘基的前肽部分，中間由??含２５４個氣基酸殘基的成熟ｃａｔｈｅｐｓｉｎ?Ｂ蛋白組成，而在Ｃ末端則包含６個氨基??酸殘基的延伸部分［３１］。在組織蛋白酶前體蛋白中，前肽以一種與底物相反的方向??存在于活性位點溝槽中，這種排列方式恰好阻止了該蛋白在近中性ｐＨ比如粗面內(nèi)質(zhì)??網(wǎng)和高爾基體中起到裂解作用［３２］。與其他組織蛋白酶相比，組織蛋白酶Ｂ廣泛??存在于動物的各個組織與器官中，且在細(xì)胞外環(huán)境中該酶的穩(wěn)定性遠(yuǎn)高于其他同??種酶［３３－３５］。??暴??＊７?ＡＳＮ??圖２．?ｃａｔｈｅｐｓｉｎ?Ｂ蛋白結(jié)構(gòu)示意圖［３０］??４??

山東大學(xué)碩士學(xué)位論文５?６７?Ｓ９?１０??Ｈ?Ｈ?ＩＡＴＧＣＣＡＡＡＧＴＧＡ６ＴＧＴＧＧＡＧＡＴＣＴＣＣＴＣＴＣＡＧＴＡＣＧＧＴＴＴＣＡＣＴＣＡＣＡＣＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＧＡＧＴＣ圖３．?ｃ姑《基因敲除粑位點設(shè)計??體構(gòu)建??的制備??Ｂｂｓｌ酶切ｐＴ７－ｇＲＮＡ質(zhì)粒，切膠回ｇＲＮＡ－ＢｂｓＩ（圖?４）。??


本文編號：2985315