Fat1基因編碼n-3多不飽和酸脫氫酶,可以將多不飽和脂肪酸從n-6轉(zhuǎn)化為n-3形式,提高動(dòng)物體內(nèi)n-3的含量。由于人體不能自身合成n-3多不飽和脂肪酸,只能從食物中攝取,因此將Fat1基因轉(zhuǎn)入家畜體內(nèi)具有廣泛的應(yīng)用前景。MSTN基因?qū)儆谵D(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β超家族,是骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育的負(fù)調(diào)控因子,MSTN基因突變的動(dòng)物會(huì)表現(xiàn)出肌肉過(guò)度肥大的現(xiàn)象,稱為“雙肌現(xiàn)象”,雙肌動(dòng)物與普通動(dòng)物相比,具有生長(zhǎng)速度快、瘦肉率高而脂肪含量低的特點(diǎn)。CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)由于成本低、操作簡(jiǎn)單、切割效率高等特點(diǎn),被應(yīng)用于基因敲除、定點(diǎn)敲入、多位點(diǎn)同時(shí)敲除等技術(shù)領(lǐng)域中。實(shí)驗(yàn)室于2016年獲得了Fat1基因定點(diǎn)整合入MSTN基因中的基因打靶絨山羊。本研究對(duì)得到的基因打靶絨山羊進(jìn)行了PCR、Southern Blot、Western Blot、實(shí)時(shí)定量PCR、脂肪酸含量、肌纖維直徑、血常規(guī)以及血液生化分析等方面的檢測(cè),探討Fat1基因定點(diǎn)整合、MSTN基因敲除對(duì)相關(guān)基因表達(dá)以及基因打靶絨山羊健康的影響。1)外源基因整合鑒定采集Fat1基因打靶絨山羊的血液,提取基因組進(jìn)行PCR鑒定,分離了Fat1基因打靶絨山羊... 

【文章來(lái)源】：內(nèi)蒙古大學(xué)內(nèi)蒙古自治區(qū) 211工程院校

【文章頁(yè)數(shù)】：84 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

基因打靶載體元件

GAPDH 36 0.2A /1h10minMSTN 27 0.2A /1h驗(yàn)結(jié)果外源基因整合的鑒定1 耳尖成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)本實(shí)驗(yàn)采用組織塊貼壁法分離絨山羊的耳尖成纖維細(xì)胞。培養(yǎng) 5 天后有成纖維細(xì)胞從爬出（見(jiàn)圖 1.2A），約 10 天長(zhǎng)到 80%-90%匯合度，將細(xì)胞傳代一次后凍存，解凍后用圖 1.2B 為解凍后傳代一次的細(xì)胞）。從圖中可以看出，從組織塊爬出的細(xì)胞長(zhǎng)勢(shì)良好形態(tài)為梭型，經(jīng)過(guò)傳代培養(yǎng)的耳尖成纖維細(xì)胞長(zhǎng)勢(shì)良好，可供后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

掠甕?幢?PCR 產(chǎn)物以及 867bp Fat1 隨機(jī)插入產(chǎn)物（如圖1.3），測(cè)序，與預(yù)期相符，初步證明外源基因 Fat1 成功定點(diǎn)整合到 MSTN 位點(diǎn)。圖 1.3 基因打靶絨山羊 PCR 鑒定M:250bp DNA maker；1：跨上游同源臂 PCR 產(chǎn)物，1560bp；2：跨下游同源臂 PCR 產(chǎn)物，1767bp；3：Fat1基因 PCR 產(chǎn)物 867bp；4：質(zhì)粒 PCR 陽(yáng)性對(duì)照 867bpFig1.3 Electrophoresis of PCR productionM:250bp DNA maker;1: amplification of the 5’- junction,1560bp; 2:amplification of the 3’- junction,1767bp;3:fat-1 random integration PCR product,867bp:4:plasmid positive control,867bp3.1.3 Southern Blot 檢測(cè)3.1.3.1 Southern Blot 探針合成瓊脂糖凝膠電泳分離鑒定 PCR 產(chǎn)物，得到的片段大小及測(cè)序與預(yù)期結(jié)果相符，運(yùn)用地高辛標(biāo)記 PCR 膠回收產(chǎn)物并進(jìn)行探針效率檢測(cè)。如圖 1.4 ， PCR 產(chǎn)物條帶明亮、單一，測(cè)序結(jié)果完全正確，可用于后續(xù) Southern Blot 實(shí)驗(yàn)。34


本文編號(hào)：2975653