發(fā)布時(shí)間：2021-01-10 05:56

　　馬鈴薯（Solanum tuberosum L.）,屬于世界第三大重要農(nóng)作物,低溫危害一直是限制馬鈴薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要因素之一。因此,開展馬鈴薯耐受低溫相關(guān)的研究,意義重大。本實(shí)驗(yàn)室前期利用甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性（methylation sensitive amplification polymorphism,MSAP）技術(shù)獲得了3個(gè)與馬鈴薯低溫應(yīng)答相關(guān)的基因,分別是琥珀酰輔酶A連接酶α亞基（succinyl-CoA ligase subunitα,StSUCLα）、醛酮還原酶（aldo-keto reductase,StAKR）、葉綠素a-b結(jié)合蛋白（chlorophyll a-b binding protein,StCab）。為了確定這三個(gè)基因在馬鈴薯響應(yīng)低溫脅迫過程中的功能,該研究以馬鈴薯主栽品種“大西洋”為材料,利用qPCR技術(shù)分析了StSUCLα、StAKR和StCab表達(dá)與低溫脅迫之間的相關(guān)性;利用VIGS技術(shù)在本氏煙草中沉默了NbSUCLα、NbAKR和NbCab,觀察植物的發(fā)育表型及低溫耐受能力,初步分析了3個(gè)基因的功能;利用Confocal技術(shù)對(duì)StAKR和StCab進(jìn)行... 

【文章來源】：內(nèi)蒙古科技大學(xué)內(nèi)蒙古自治區(qū)

【文章頁數(shù)】：66 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

技術(shù)路線圖

高質(zhì)量的RNA是進(jìn)行qRT-PCR實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵。本實(shí)驗(yàn)用RNA提取試劑盒分別提取4℃和室溫下處理了0 h、12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h的在MS固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)30日齡左右的馬鈴薯主栽品種“大西洋”組織的總RNA,如圖2.1顯示:RNA電泳條帶整齊清晰,可以清楚的看到有三條條帶,分別是28S rRNA、18S rRNA和5S rRNA,說明RNA樣品質(zhì)量很好,可以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。2.3.2 低溫脅迫下目的基因表達(dá)水平發(fā)生變化

將上述提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為c DNA,以此為模板,進(jìn)行qRT-RCR實(shí)驗(yàn),根據(jù)Ct值計(jì)算各目的基因的相對(duì)表達(dá)量,此時(shí)默認(rèn)0 h下各目的基因相對(duì)表達(dá)量為1。如圖2.2、2.3、2.4所示,可以看到低溫脅迫下目的基因StSUCLα、StAKR、StCab的相對(duì)基因表達(dá)量都出現(xiàn)了變化。分析圖2.2可以發(fā)現(xiàn)隨著低溫脅迫“大西洋”時(shí)間的延長(zhǎng),StSUCLα基因的相對(duì)表達(dá)量總體呈現(xiàn)出先升后降再升的趨勢(shì),在0~12 h StSUCLα基因表達(dá)上調(diào),12~36 h表達(dá)下調(diào),36~72 h表達(dá)又上調(diào),并且在72 h時(shí)表達(dá)量最高。與對(duì)照比,低溫下StSUCLα基因表達(dá)量高于對(duì)照;分析圖2.3可以發(fā)現(xiàn)隨著低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng),StAKR基因的相對(duì)表達(dá)量總體呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì),在0~12 h StAKR基因表達(dá)上調(diào),12~72 h內(nèi)StAKR基因表達(dá)下調(diào)。與對(duì)照相比,在0~12 h時(shí)低溫下StAKR的表達(dá)量高于對(duì)照,而在12~72 h時(shí)間段內(nèi)低溫下StAKR的表達(dá)量低于對(duì)照;分析圖2.4可以發(fā)現(xiàn)隨著低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng),StCab相對(duì)表達(dá)量總體呈下降趨勢(shì),其中“大西洋”在低溫處理12h時(shí)StCab基因表達(dá)量減少的最多,后續(xù)基因表達(dá)量的變化基本保持穩(wěn)定,與對(duì)照相比,整個(gè)處理時(shí)間段內(nèi)低溫下StCab基因表達(dá)量始終低于對(duì)照。圖2.3 qRT-PCR分析低溫脅迫下StAKR相對(duì)表達(dá)量


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