隨著社會的快速發(fā)展,對生產(chǎn)生物能源的可再生資源的需求日益增加,國內(nèi)外研究學(xué)者將目標放在了不占用耕地、可持續(xù)供應(yīng)的海洋藻類上面。雖然理論上利用褐藻進行生物乙醇發(fā)酵是可行性,但進行工業(yè)化生產(chǎn)還難以實現(xiàn),主要因為工業(yè)微生物菌株難以有效降解褐藻膠生成其可利用的單糖,因此尋求高效降解褐藻膠的裂解酶顯得非常重要。本項研究旨在為褐藻膠的生物轉(zhuǎn)化提供具有高酶活和廣泛底物特異性的褐藻膠裂解酶,研究結(jié)果總結(jié)如下:（1）從腐爛海帶中分離得到多株褐藻膠降解菌,通過透明圈定性及酶活力定量測定篩選出褐藻膠裂解酶酶活最高的菌株BH17,經(jīng)16S rRNA序列比對及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,鑒定為解藻酸弧菌。對其進行生長特性和產(chǎn)酶條件的研究,發(fā)現(xiàn)該菌株最適產(chǎn)酶培養(yǎng)基為:0.6%海藻酸鈉,0.6%磷酸氫二銨,0.2%磷酸氫二鉀,4%氯化鈉,0.1%七水硫酸鎂。最適產(chǎn)酶pH為6.5-7.0,溫度為20-25℃,發(fā)酵時間48 h。在以上優(yōu)化條件下,每OD₆₂₀的酶活達到83 U/mL,優(yōu)于目前已報道的多數(shù)菌株酶活。（2）采用Escherichia coli（E.coli）表達體系對褐藻膠裂解酶相關(guān)基因進行克隆表... 

【文章來源】：大連理工大學(xué)遼寧省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：86 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
引言
1 文獻綜述
    1.1 褐藻簡介
        1.1.1 褐藻的特性
        1.1.2 褐藻的主要組成成分
    1.2 褐藻膠
        1.2.1 褐藻膠的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)
        1.2.2 褐藻膠的降解方法
    1.3 褐藻膠寡糖的應(yīng)用與前景
    1.4 褐藻膠裂解酶
        1.4.1 褐藻膠裂解酶的來源與分類
        1.4.2 褐藻膠裂解酶的結(jié)構(gòu)
        1.4.3 褐藻膠裂解酶底物特異性及與結(jié)構(gòu)的關(guān)系
        1.4.4 褐藻膠裂解酶活性檢測方法
        1.4.5 褐藻膠裂解酶的功能與應(yīng)用前景
    1.5 褐藻產(chǎn)生物乙醇的研究現(xiàn)狀
    1.6 本課題的研究內(nèi)容及研究意義
2 褐藻膠降解菌的篩選、鑒定及產(chǎn)酶條件優(yōu)化
    2.1 引言
    2.2 材料
        2.2.1 主要實驗儀器
        2.2.2 主要實驗試劑
        2.2.3 培養(yǎng)基
    2.3 實驗方法
        2.3.1 菌種來源
        2.3.2 褐藻膠降解菌的篩選
        2.3.3 菌種保藏
        2.3.4 菌株鑒定與分析
        2.3.5 產(chǎn)酶條件優(yōu)化
    2.4 結(jié)果與討論
        2.4.1 褐藻膠降解菌的篩選與鑒定
        2.4.2 種子培養(yǎng)基菌株BH17的生長曲線
        2.4.3 培養(yǎng)基成分優(yōu)化
        2.4.4 發(fā)酵條件的優(yōu)化
    2.5 小結(jié)
3 褐藻膠裂解酶基因的克隆表達
    3.1 引言
    3.2 材料
        3.2.1 菌株和質(zhì)粒
        3.2.2 培養(yǎng)基
        3.2.4 試劑
        3.2.5 主要實驗儀器
    3.3 實驗方法
        3.3.1 引物設(shè)計及序列比對
        3.3.2 質(zhì)粒提取與E.coliDH5α感受態(tài)的制備
        3.3.3 PCR法擴增褐藻膠降解關(guān)鍵酶基因
        3.3.4 重組載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化
        3.3.5 重組酶的表達及檢測
        3.3.6 重組酶的酶活測定方法
        3.3.7 誘導(dǎo)條件的優(yōu)化
    3.4 結(jié)果與討論
        3.4.1 褐藻膠裂解酶基因的克隆及表達載體的構(gòu)建
        3.4.2 五株重組菌褐藻膠裂解酶的表達
        3.4.3 五株重組菌褐藻膠裂解酶的酶活測定
        3.4.4 rAlgV3誘導(dǎo)條件的優(yōu)化
        3.4.5 BL21-AlgV3的高密度培養(yǎng)及誘導(dǎo)表達
    3.5 小結(jié)
4 褐藻膠裂解酶的分離純化與酶學(xué)性質(zhì)
    4.1 引言
    4.2 實驗材料
        4.2.1 主要試驗儀器
        4.2.2 主要化學(xué)試劑
        4.2.3 培養(yǎng)基
    4.3 實驗方法
        4.3.1 重力柱純化重組酶
        4.3.2 重組酶rAlgV3酶活測定
        4.3.3 WesternBloting驗證
        4.3.4 BCA法測定蛋白含量
        4.3.5 重組酶rAlgV3的酶學(xué)性質(zhì)
        4.3.6 褐藻膠裂解酶降解產(chǎn)物ESI-MS分析
    4.4 結(jié)果與分析
        4.4.1 重組蛋白酶的分離純化
        4.4.2 重組酶rAlgV3的最適溫度和熱穩(wěn)定性
        4.4.3 重組酶rAlgV3的最適pH和pH穩(wěn)定性
        4.4.4 不同離子對重組酶rAlgV3酶活的影響
        4.4.5 不同NaCl濃度對重組酶rAlgV3活性的影響
        4.4.6 重組酶rAlgV3底物偏好性分析
        4.4.7 褐藻膠裂解酶降解產(chǎn)物ESI-MS分析
    4.5 小結(jié)
結(jié)論
展望
參考文獻
附錄A BH17基因序列
附錄B VMC35240基因及蛋白序列
附錄C rAlgV3基因及蛋白序列
附錄D 常用緩沖溶液的配制方法
攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表學(xué)術(shù)論文情況
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
[1]“911”抗HBV作用的實驗研究[J]. 姜寶法,徐曉菲,李笠,袁瑋.  現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué). 2003(04)



本文編號：2924390