木聚糖是一種非均相聚合物,是半纖維素的主要成分之一。在過去的幾十年里,作為生物質(zhì)降解酶系中主要成員的木聚糖酶成為研究的熱點,其在紡織品、食品、飼料、造紙以及醫(yī)藥等多個工業(yè)領域中都得到了廣泛的應用。木聚糖酶主要作用于木聚糖的β-1,4-糖苷鍵,水解產(chǎn)生不同分子量的低聚木糖和木糖。目前,國內(nèi)外已報道的克隆表達的木聚糖酶基因中大多數(shù)在高溫下的熱穩(wěn)定性都比較差,不能滿足工業(yè)生產(chǎn)需求,這也使木聚糖酶的應用受到了極大的限制。因此,對木聚糖酶的熱穩(wěn)定性的研究具有十分重要的意義。木聚糖酶Umxyn10A（Gen Bank序列號ABL73-883.1）是由本實驗室前期從堆肥未培養(yǎng)微生物中篩選得到,屬于GH 10家族。將木聚糖酶基因Umxyn10A去掉跨膜結(jié)構(gòu)域的編碼序列并進行密碼子優(yōu)化后,將其在大腸桿菌中進行表達,結(jié)果發(fā)現(xiàn),木聚糖酶Umxyn10A最適反應溫度為80℃,但熱穩(wěn)定性較差,當溫度超過60℃時酶活力大幅度下降,其在65℃下的半衰期為15 min,在75℃下保溫4 min就幾乎失活。木聚糖酶 Umxyn 10A的最適pH為6.0,在pH 4.5～10.0范圍能保持80%以上的酶活。該酶除了對木聚... 

【文章來源】：廣西大學廣西壯族自治區(qū) 211工程院校

【文章頁數(shù)】：87 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖１－３木聚糖酶的空間結(jié)構(gòu)１２８］??

圖２－１?ＰＣＲ擴增突變酶基因的流程圖??Ｆｉｇ．２－１?Ｆｌｏｗ?ｃｈａｒｔ?ｏｆ?ＰＣＲ?ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｍｕｔａｎｔ?ｅｎｚｙｍｅ?ｇｅｎｅｓ??第一輪：以質(zhì)粒ｐＥＴ３０ａ－Ｕｍｘｙｎｌ０Ａ為模板，ＹＳＸＬ－Ｆ，Ｔ１２１Ｅ－Ｌｅｆｉ－Ｒ分別為上下物，擴增出以突變位點為界的左片段（Ａ片段），以Ｔ１２１Ｅ－Ｒｉｇｈｔ－Ｆ，?ＹＳＸＬ－Ｒ分上下游引物擴增出右片段（Ｂ片段）。具體反應體系如下表２－４?（以擴增突變點Ｔ１２１Ａ片段為例）。對于突變位點靠近ＵｍｘｙｎｌＯＡ的Ｎ端或Ｃ末端（如Ａ２６Ｐ，Ｎ３１２Ｄ）突變位點，因需要擴增的片段太短，以ｐＥＴ３０ａ的前引物（Ｔ７）或后引物（Ｔ７ｔｅｒｍｉｎｎａｔｏ行片段擴增。ＰＣＲ反應條件，除退火溫度、退火時間不同，其它條件和ＵｍｘｙｎｌＯ因的擴增保持一致。??

富?蛟詿蟪Ω司?械鬧刈楸澩錛捌淙妊}定性的改造??據(jù)測定的結(jié)果繪制木糖標準曲線，如圖２－３所示：??３．５?－?ｙ?＝?３．４０７８ｘ－０．０２０２??Ｒ２?＝?０．９９９??Ｉ１５＇??〇?２?Ｘ??１?Ｘ??。：：ｚ??０??１?１?．?１?１???０?０．２?０．４?０．６?０．８?１??Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ?（ｕｇ／ｍｌ）??圖２－３木糖標準曲線??Ｆｉｇ．?２－３?Ｘｙｌｏｓｅ?ｓｔａｎｄａｒｄ?ｃｕｒｖｅ??２．木聚糖酶酶活的測定方法：酶活測定參照Ｍｉｌｌｅｒ�。福保莸姆椒ǎ锰囟ǖ木彌_液配制??１％木聚糖（ｂｅｅｃｈｗｏｏｄ?ｘｙｌａｎ）作為底物，取４５０?｜ｉｉＬ于２?ｍＬＥＰ管中（每組三個平行），??在最適溫度下預熱５?ｍｉｎ后，加入５０?ｐＬ適當稀釋后的酶液（滅活后的酶液作為空白對??照），反應１０ｍｉｎ，反應結(jié)束后分別加入ｌｍＬ的ＤＮＳ終止反應。然后，將ＥＰ管架放??入沸水中，煮沸１０?ｍｉｎ，冷卻至室溫。最后吸�。玻埃�?ｐＬ的溶液到９６孔酶標板中，測定??其在５４０?ｎｍ下的吸光值。根據(jù)標準曲線計算出其酶活力。??２．２．６．４蛋白濃度標準曲線的制備??１．蛋白濃度標準曲線的制備方法如下：配制ｌｍｇ／ｍｌ的小牛血清蛋白（ＢＳＡ）標準??溶液，按表２－１０所示的量吸取各種溶液到ＥＰ管中并混合均勻，在室溫放置５?ｍｉｎ，吸??取２００?ｐＬ的混合溶液到９６孔酶標板中，在５９５?ｎｍ處檢測吸收光值，以蛋白濃度為橫??坐標

【參考文獻】：
期刊論文
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博士論文
[1]宇佐美曲霉木聚糖酶AusXyn10A的克隆表達及耐熱性的改造研究[D]. 汪俊卿.江南大學 2014
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碩士論文
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本文編號：2911726