成簇規(guī)則相間的短回文重復(fù)（CRISPR/Cas）系統(tǒng)是近年新興的一項RNA介導(dǎo)的核酸酶靶向基因編輯技術(shù)。本研究利用該系統(tǒng)對水稻中5個功能未知的OsGRF（Growth-Regulating Factor）基因家族成員（OsGRF3/7/8/9/11）進(jìn)行定點突變試驗,構(gòu)建了基因敲除株系,并從突變效率、類型及它們的合子型3個方面對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行了比較分析。主要結(jié)果如下：1、突變效率。在5個靶基因OsGRF3/7/8/9/11的T0代中,敲除植株占總植株的比例分別是22/25、38/47、22/22、12/16和22/22,突變株頻率在75.0—100.0%之間,體現(xiàn)了該技術(shù)對水稻基因定點敲除的高效性。實驗中采用玉米ZmUbi的啟動子驅(qū)動水稻密碼子優(yōu)化的Cas9蛋白的表達(dá),同時由水稻OsU6啟動子驅(qū)動gRNA的表達(dá)。推測可能正是這些核心組分的改造提高了靶向編輯的效率。2、突變類型。T0代靶標(biāo)位點上絕大多數(shù)（約95%）發(fā)生≤3 bp的短片段缺失或插入突變,其中1 bp插入堿基組分多偏好于T和A（占89.3%）,說明Cas9/gRNA復(fù)合體造成的DNA雙鏈斷裂可能多由內(nèi)源NHEJ途徑介導(dǎo)易錯修復(fù)... 

【文章來源】：福建農(nóng)林大學(xué)福建省

【文章頁數(shù)】：41 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
前言
1 文獻(xiàn)綜述
    1.1 植物GRF基因家族
        1.1.1 擬南芥AtGRF家族的功能研究
        1.1.2 水稻OsGRF家族的研究進(jìn)展
        1.1.3 GRF家族在其他植物中的研究
    1.2 CRISPR/Cas基因編輯系統(tǒng)
        1.2.1 CRISPR/Cas系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)及作用機(jī)理
        1.2.2 Cas9/gRNA系統(tǒng)的開發(fā)利用
        1.2.3 Cas9/gRNA系統(tǒng)在水稻中的應(yīng)用和表達(dá)優(yōu)化
2 材料與方法
    2.1 實驗材料
    2.2 Cas9/gRNA敲除載體的構(gòu)建
    2.3 轉(zhuǎn)基因植株的檢測與鑒定
3 結(jié)果與分析
    3.1 Cas9/gRNA敲除株系的構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因檢測
    3.2 各靶基因間的編輯效率比較
    3.3 靶點突變類型的比較
    3.4 突變合子型及后代分離檢測
4 討論
    4.1 突變效率的影響因素分析
    4.2 突變類型的比例分析
    4.3 突變合子型和遺傳特性的初步分析
5 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
附錄
    附錄1 各靶基因的gRNA引物序列
    附錄2 實驗用的PCR引物
    附錄3 SDS小量提取水稻葉片總DNA
致謝



本文編號：2911899