利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建Dppa5a基因敲除小鼠模型并分析表型
發(fā)布時(shí)間：2020-12-11 11:19
發(fā)育多潛能性維持因子5A（Dppa5a）是多能性細(xì)胞的標(biāo)記基因。它在早期胚胎、生殖細(xì)胞系和胚胎干細(xì)胞（ES）中特異性表達(dá),可能介導(dǎo)RNA轉(zhuǎn)錄、調(diào)控卵子發(fā)生和胚胎發(fā)育。CRISPR/Cas9是一項(xiàng)新興的基因編輯技術(shù),可以對(duì)基因進(jìn)行高效的切割。本實(shí)驗(yàn)使用CRISPR/Cas9技術(shù),通過(guò)顯微注射的方式構(gòu)建Dppa5a基因敲除(Dppa5a-/-)小鼠模型,分析Dppa5a-/-小鼠表型,從而研究該基因在小鼠生長(zhǎng)發(fā)育中的作用。1.野生型（WT）小鼠卵母細(xì)胞及早期胚胎中Dppa5a的表達(dá)分析通過(guò)定量PCR技術(shù)分析Dppa5a基因在卵母細(xì)胞和早期胚胎中的表達(dá)量,結(jié)果發(fā)現(xiàn):在GV期卵母細(xì)胞中,SN構(gòu)型卵母細(xì)胞Dppa5a基因的表達(dá)明顯低于NSN中的表達(dá),且差異極顯著（p=0.0075）。在早期胚胎中,MII期積累的大量RNA在受精后開(kāi)始急劇下降,至2細(xì)胞階段降到最低,僅為原來(lái)的9.0%;之后又慢慢積累,在桑椹胚時(shí)表達(dá)量達(dá)到頂峰,是MII時(shí)期的3.83倍。2.構(gòu)建Dppa5a-/-小鼠模型在Dppa5a基因的第二個(gè)外顯子功能域上設(shè)計(jì)兩條...
【文章來(lái)源】：阜陽(yáng)師范大學(xué)安徽省
【文章頁(yè)數(shù)】：64 頁(yè)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【部分圖文】：
使用雙鏈斷裂的基因組編輯[4]
CRISPR/Cas 技術(shù)之所以被發(fā)現(xiàn)是因?yàn)閷?duì)細(xì)菌本身防御系統(tǒng)的研究[14][15][16]。在（古）細(xì)菌基因組中存在著一種被一定長(zhǎng)度的間隔序列分開(kāi)的重復(fù)序列，間隔序列的長(zhǎng)度根據(jù)細(xì)菌的種類(lèi)和 CRISPR 位點(diǎn)不同會(huì)有所變化。這些間隔序列和噬菌體或質(zhì)粒序列相似性很高[17][18]，這說(shuō)明這些間隔序列不屬于細(xì)菌本身。間隔序列在被轉(zhuǎn)錄成為 crRNA后，能夠和細(xì)菌自身的 Cas 核酸酶形成復(fù)合體并起到指引作用[19]。1.1 CRISPR/Cas 系統(tǒng)的發(fā)展及應(yīng)用CRISPR/Cas 的故事開(kāi)始于 1987 年，2013 年首次將此系統(tǒng)用于基因組編輯，在此之后，這個(gè)領(lǐng)域發(fā)展迅速。被應(yīng)用于基因組編輯，CRISPR/Cas9 技術(shù)可以通過(guò) SgRNA序列將 Cas9 蛋白指引到目的基因的特定位點(diǎn)上，Cas9 進(jìn)行切割使 DNA 斷裂。最近的幾項(xiàng)研究，CRISPR/Cas9 技術(shù)被應(yīng)到疾病的治療中，這對(duì)臨床基因治療的發(fā)展有了巨大的推動(dòng)作用（如圖 1.2）。
阜陽(yáng)師范學(xué)院碩士學(xué)位論文識(shí)別并將其切成小片段（Spacer），將其安裝到基因組內(nèi)的 CRISPR 基因隔區(qū)在直接重復(fù)序列之間隔離，使 CRISPR 系統(tǒng)能夠介導(dǎo)自我和非自我段是 crRNA 成熟，CRISPR 序列轉(zhuǎn)錄為長(zhǎng)的 RNA，然后被剪接成 crRN對(duì)外源遺傳物質(zhì)的識(shí)別與切割，tracrRNA、crRNA 和 Cas9 形成復(fù)合體NA 序列并結(jié)合上去，引導(dǎo)復(fù)合體實(shí)現(xiàn)切割[19][50]（如圖 1.4 a）。
【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]胰高血糖素樣肽-2功能的研究新進(jìn)展[J]. 馬麗娜,畢會(huì)民,高凌. 中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào). 2017(27)
[2]胚胎干細(xì)胞中DPPA2和DPPA4蛋白相互作用的研究[J]. 楊潔,雷霆鈞,田平平,吳傳芳,歐陽(yáng)勁,秦嶺. 四川大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版). 2013(02)
[3]DPPA2基因的研究進(jìn)展[J]. 趙謙,杜娟. 現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展. 2011(18)
[4]豬多潛能性維持因子5 cDNA全序列的克隆與分析[J]. 李勇,王立剛,王立賢,喬麗娟,張龍超,顏華. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào). 2010(02)
碩士論文
[1]豬Dppa5, FP和MAL2基因遺傳多態(tài)性與繁殖性狀的關(guān)聯(lián)分析[D]. 李穩(wěn).中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 2011
本文編號(hào)：2910438
【文章來(lái)源】：阜陽(yáng)師范大學(xué)安徽省
【文章頁(yè)數(shù)】：64 頁(yè)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【部分圖文】：
使用雙鏈斷裂的基因組編輯[4]
CRISPR/Cas 技術(shù)之所以被發(fā)現(xiàn)是因?yàn)閷?duì)細(xì)菌本身防御系統(tǒng)的研究[14][15][16]。在（古）細(xì)菌基因組中存在著一種被一定長(zhǎng)度的間隔序列分開(kāi)的重復(fù)序列，間隔序列的長(zhǎng)度根據(jù)細(xì)菌的種類(lèi)和 CRISPR 位點(diǎn)不同會(huì)有所變化。這些間隔序列和噬菌體或質(zhì)粒序列相似性很高[17][18]，這說(shuō)明這些間隔序列不屬于細(xì)菌本身。間隔序列在被轉(zhuǎn)錄成為 crRNA后，能夠和細(xì)菌自身的 Cas 核酸酶形成復(fù)合體并起到指引作用[19]。1.1 CRISPR/Cas 系統(tǒng)的發(fā)展及應(yīng)用CRISPR/Cas 的故事開(kāi)始于 1987 年，2013 年首次將此系統(tǒng)用于基因組編輯，在此之后，這個(gè)領(lǐng)域發(fā)展迅速。被應(yīng)用于基因組編輯，CRISPR/Cas9 技術(shù)可以通過(guò) SgRNA序列將 Cas9 蛋白指引到目的基因的特定位點(diǎn)上，Cas9 進(jìn)行切割使 DNA 斷裂。最近的幾項(xiàng)研究，CRISPR/Cas9 技術(shù)被應(yīng)到疾病的治療中，這對(duì)臨床基因治療的發(fā)展有了巨大的推動(dòng)作用（如圖 1.2）。
阜陽(yáng)師范學(xué)院碩士學(xué)位論文識(shí)別并將其切成小片段（Spacer），將其安裝到基因組內(nèi)的 CRISPR 基因隔區(qū)在直接重復(fù)序列之間隔離，使 CRISPR 系統(tǒng)能夠介導(dǎo)自我和非自我段是 crRNA 成熟，CRISPR 序列轉(zhuǎn)錄為長(zhǎng)的 RNA，然后被剪接成 crRN對(duì)外源遺傳物質(zhì)的識(shí)別與切割，tracrRNA、crRNA 和 Cas9 形成復(fù)合體NA 序列并結(jié)合上去，引導(dǎo)復(fù)合體實(shí)現(xiàn)切割[19][50]（如圖 1.4 a）。
【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]胰高血糖素樣肽-2功能的研究新進(jìn)展[J]. 馬麗娜,畢會(huì)民,高凌. 中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào). 2017(27)
[2]胚胎干細(xì)胞中DPPA2和DPPA4蛋白相互作用的研究[J]. 楊潔,雷霆鈞,田平平,吳傳芳,歐陽(yáng)勁,秦嶺. 四川大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版). 2013(02)
[3]DPPA2基因的研究進(jìn)展[J]. 趙謙,杜娟. 現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展. 2011(18)
[4]豬多潛能性維持因子5 cDNA全序列的克隆與分析[J]. 李勇,王立剛,王立賢,喬麗娟,張龍超,顏華. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào). 2010(02)
碩士論文
[1]豬Dppa5, FP和MAL2基因遺傳多態(tài)性與繁殖性狀的關(guān)聯(lián)分析[D]. 李穩(wěn).中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 2011
本文編號(hào)：2910438
本文鏈接：http://sikaile.net/kejilunwen/jiyingongcheng/2910438.html
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