野燕麥?zhǔn)且环N世界性惡性農(nóng)田雜草,主要以化學(xué)防治為主,由于除草劑大量單一使用,已經(jīng)產(chǎn)生嚴(yán)重的抗性。為了明確野燕麥對(duì)除草劑的抗性及其機(jī)理,本文采用整株測(cè)定法測(cè)定了24個(gè)野燕麥種群對(duì)精噁唑禾草靈的敏感度以及離體條件下測(cè)定其乙酰輔酶A羧化酶(ACCase)對(duì)精噁唑禾草靈的敏感度,并進(jìn)一步探討了野燕麥相對(duì)抗性種群和敏感種群ACCase基因相對(duì)表達(dá)量差異以及ACCase氨基酸序列突變點(diǎn)檢測(cè)。具體結(jié)果如下:1、通過(guò)整株測(cè)定法測(cè)定了24個(gè)野燕麥種群對(duì)精噁唑禾草靈的敏感度。結(jié)果表明,就莖而言,對(duì)精噁唑禾草靈最不敏感的野燕麥種群是西華(周口),其IC_(50)的值為643.790g.a.i/hm~2,襄縣(許昌)是最敏感的種群,其IC_(50)值為4.23 g.a.i/hm~2,兩者相差151.2倍;就根而言,武陟(焦作)是最不敏感的地區(qū),其IC_(50)為2977.041 g.a.i/hm~2,鄢陵(許昌)是最敏感的地區(qū),其IC_(50)為793.75 g.a.i/hm~2,兩者相差2.75倍。雖然根與莖對(duì)精噁唑禾草靈的敏感度差異性很大,但均表明,野燕麥對(duì)精噁唑禾草靈產(chǎn)生了不同程度的抗性。2、離體條件下測(cè)定了24個(gè)野燕麥種群ACCase對(duì)精噁唑禾草靈的敏感度。結(jié)果表明,鶴山(鶴壁)地區(qū)的野燕麥種群ACCase對(duì)精噁唑禾草靈的敏感度最高,其IC_(50)為11.334 mg/L;社旗(南陽(yáng))地區(qū)野燕麥種群ACCase對(duì)精噁唑禾草靈的敏感度最低,其IC_(50)為17720.677mg/L。綜合不同種群野燕麥對(duì)精噁唑禾草靈的敏感度來(lái)看,對(duì)精噁唑禾草靈敏感度低的野燕麥種群,其ACCase對(duì)精噁唑禾草靈的敏感度也都較低,反之亦然。這說(shuō)明野燕麥對(duì)精噁唑禾草靈的抗性與ACCase關(guān)系密切。3、用IC_(10)(6.9 mg/L)的精噁唑禾草靈處理24小時(shí)后,采集樣本并構(gòu)建cDNA文庫(kù),然后通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA-Seq)篩選出差異表達(dá)的ACCase基因,最后利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)其中相似度最高的ACCase基因進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果共篩選出8個(gè)注釋為乙酰輔酶A羧化酶的unigenes,其中有5個(gè)下調(diào),3個(gè)上調(diào)。為了進(jìn)一步明確ACCase與野燕麥對(duì)精噁唑禾草靈抗藥性之間的關(guān)系。我們用精噁唑禾草靈分別處理社旗(Y21),西華(Y3),召陵(Y24)三個(gè)抗性種群和敏感種群鶴山(Y11),24 h后收集樣本,通過(guò)熒光定量PCR(qRT-PCR)技術(shù)分析精噁唑禾草靈對(duì)其ACCase基因表達(dá)的影響。結(jié)果表明,3個(gè)抗性種群與一個(gè)敏感種群的ACCase基因的相對(duì)表達(dá)量均受到了精噁唑禾草靈的抑制,但抗性種群受到的抑制程度明顯要小于敏感種群。這表明野燕麥對(duì)精噁唑禾草靈的抗性與ACCase基因的表達(dá)能力有關(guān)。將3個(gè)抗性種群ACCase基因相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行比較,我們發(fā)現(xiàn)ACCase基因相對(duì)表達(dá)量由高到低依次為社旗(Y21),西華(Y3),召陵(Y24),與ACCase對(duì)精噁唑禾草靈敏感度測(cè)定結(jié)果一致。4、為了驗(yàn)證野燕麥對(duì)精噁唑禾草靈的抗性是否由ACCase基因突變引起。我們將遂平(Y19),社旗(Y21),西華(Y3),召陵(Y24)4個(gè)相對(duì)抗性種群和鶴山(Y11),溫縣(Y7),舞陽(yáng)(Y9),淮陽(yáng)(Y16)4個(gè)相對(duì)敏感種群的ACCase基因進(jìn)行克隆,然后與大穗看麥娘(Alopecurus myosuroides,GeneBank accession No.AJ310767)ACCase全長(zhǎng)基因進(jìn)行多序列比對(duì)。結(jié)果表明,所測(cè)地區(qū)野燕麥種群在已報(bào)道的ACCase氨基酸序列突變(Ile-1781-Leu,Trp-1999-Cys,Trp-2027-Cys,Ile-2041-Asn,Asp-2078-Gly,Cys-2088-Arg)處均沒(méi)有發(fā)生點(diǎn)突變。這表明我們所測(cè)定的野燕種群對(duì)精噁唑禾草靈的抗藥性不是由所報(bào)道的靶標(biāo)位點(diǎn)突變引起的。
【學(xué)位單位】：河南科技學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S451
【部分圖文】：

BCCP）亞基，生物素羧化酶（biotin carboxylase，BC）亞基和轉(zhuǎn)羧酶（biotintranscarboxylase，CT）的α亞基（CTα）與β亞基 （CTβ）這四個(gè)亞基組成。BCCP 亞基和 BC 亞基為同型二聚體，CTα 和 CTβ為異型二聚體，兩者以共價(jià)鍵相連，形成 CT 催化域。以上四個(gè)亞基結(jié)合在一起形成 ACCase 全酶，可能以（BC）2（BCCP）4（CTα, CTβ）2的形式存在[7]，但異質(zhì)型的 ACCase 并不穩(wěn)定，容易解離。同質(zhì)型的 ACCase 為真核類型 ACCase[8]，它的一條多肽鏈含有異質(zhì)型 ACCase 所有 4 個(gè)亞基，這四個(gè)亞基按照 BC、BCCP、CTβ、CTα的順序排列，形成了 BC，BCCP 和 CT 三個(gè)功能域（CTβ 和 CTα 算一個(gè)功能域）（如圖 1-1）[9-11]。相對(duì)于異質(zhì)性 ACCase，在活性狀態(tài)下的同質(zhì)型 ACCase呈現(xiàn)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，不易解離的同型二聚體。所有生物體內(nèi)同質(zhì)型 ACCase 都具有相同的組織結(jié)構(gòu)：NH2-BC-BCCP-CT-COOH。此外這兩種 ACCase（ACCaseⅠ和 ACCaseⅡ）還存在兩個(gè)特殊情況：第一就是在禾本科植物中，無(wú)論是質(zhì)體還是胞質(zhì)溶膠，它們的ACCase 類型都是同質(zhì)型（如圖 1-2）[12]；第二是油菜的葉綠體有可能同時(shí)含有 ACCaseⅠ和 ACCaseⅡ。

第一章 緒論類 ACCase 僅由α和β兩個(gè)亞基組成，其中α亞基包含 BC 和 BCCP 兩個(gè)功能域，β亞基包含 CT 功能域。第四類 ACCase 是在古細(xì)菌（Melallosphaera .sedula）研究中發(fā)現(xiàn)的，該類 ACCase 的結(jié)構(gòu)與異質(zhì)型 ACCase 較為相似，唯一不同的地方為 CT 功能域只由一個(gè)亞基組成[7]。

圖 1-2 植物體內(nèi)乙酰輔酶 A 羧化酶類型Fig 1-2 Structures of plant ACCase1.1.2 植物體內(nèi)乙酰輔酶 A 羧化酶羧化酶的功能兩種 ACCase 在植物體內(nèi)脂肪酸合成中發(fā)揮的作用各不相同（如圖 1-3），ACCaseⅡ首先是通過(guò)其 BC 域的催化和 ATP 的參與下發(fā)生羧化作用，使與蛋白結(jié)合的生物素輔基羧化，然后再在 CT 域的催化作用下將羧基從生物素轉(zhuǎn)移到乙酰輔酶 A 羧化酶上，形成丙二酰輔酶 A，此丙二酰輔酶 A 用于脂肪酸的從頭合成。ACCaseⅠ催化生成的丙二酰輔酶 A 則用于延伸脂肪酸鏈及合成與類黃酮有關(guān)的次生代謝產(chǎn)物[15-16]
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