發(fā)布時(shí)間：2020-11-17 17:11

　　 肝癌是全球腫瘤中最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,在我國(guó)肝癌也是腫瘤相關(guān)性死亡的重要因素之一,盡管在科研領(lǐng)域和臨床上,科學(xué)家和醫(yī)務(wù)人員都做了許多的努力,但是其導(dǎo)致的癌癥相關(guān)性死亡率還是達(dá)到了第二位。這種現(xiàn)狀主要是因?yàn)楦伟┎灰自缙诎l(fā)現(xiàn),而導(dǎo)致其往往不能被及時(shí)發(fā)現(xiàn)從而不能及時(shí)接受手術(shù),錯(cuò)過(guò)最佳手術(shù)時(shí)機(jī)。而肝癌的術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移則也是一個(gè)重要的原因。所以,找到新的肝癌分子標(biāo)志物、探索肝癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制,開(kāi)發(fā)新型的、特異性的肝癌治療靶向藥物對(duì)于肝癌的治療至關(guān)重要。假基因是一種非編碼基因,即一類結(jié)構(gòu)上與編碼基因類似的基因,但是假基因的結(jié)構(gòu)中存在一些“缺陷”,導(dǎo)致他們不能編碼蛋白。最初,假基因被認(rèn)為是一種進(jìn)化上基因突變而產(chǎn)生的無(wú)功能的基因“化石”。如今,越來(lái)越多的研究證明,假基因可以在DNA、RNA及蛋白多個(gè)水平發(fā)揮許多生物學(xué)功能,特別在腫瘤生理及病理過(guò)程中假基因也參與其中并起到了重要的作用。因此,眾多假基因的發(fā)現(xiàn),功能、機(jī)制的探索,為肝細(xì)胞肝癌的早期診斷與治療預(yù)后提供了新的思路及方向。新型假基因PDIA3P1目前的研究尚處空白,本研究旨在探索假基因PDIA3P1在肝細(xì)胞肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其機(jī)制。第一部分假基因PDIA3P1在肝細(xì)胞肝癌中的表達(dá)及其臨床意義目的:研究假基因PDIA3P1在肝細(xì)胞肝癌中的表達(dá)及其臨床意義。方法:通過(guò)RT-PCR驗(yàn)證假基因PDIA3P1在肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)量;收集肝細(xì)胞肝癌病人組織,通過(guò)RT-PCR驗(yàn)證肝癌組織與癌旁組織中假基因PDIA3P1的表達(dá)情況。根據(jù)假基因PDIA3P1在臨床標(biāo)本中的表達(dá)情況,結(jié)合臨床數(shù)據(jù)資料,做假基因PDIA3P1與臨床資料相關(guān)性分析及預(yù)后生存分析。結(jié)果:在5種肝癌細(xì)胞系(Huh7、SK-Hep1、HepG2、HCCLM3 和 SMMC-7721)及一種正常肝細(xì)胞系(L02)中,假基因PDIA3P1在5種肝癌細(xì)胞系中表達(dá)較正常肝細(xì)胞系升高;90例肝癌病人組織中,假基因PDIA3P1在51對(duì)肝癌組織中高表達(dá);假基因PDIA3P1表達(dá)量高低與腫瘤大小(p=0.005)、轉(zhuǎn)移(p=0.027)和TNM分期(p=0.005)密切相關(guān);高表達(dá)假基因PDIA3P1的病人預(yù)后較低表達(dá)預(yù)后差。結(jié)論:假基因PDIA3P1是潛在的促癌基因,可能參與肝細(xì)胞肝癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程,是一種潛在的新型的肝細(xì)胞肝癌標(biāo)志物。第二部分假基因PDIA3P1對(duì)肝細(xì)胞肝癌增殖、凋亡及轉(zhuǎn)移侵襲功能的影響目的:假基因在腫瘤中的作用正受到更廣泛的關(guān)注,近年來(lái)通過(guò)對(duì)已發(fā)現(xiàn)的假基因的研究表明,假基因能夠影響腫瘤的多種不同的生物學(xué)功能。本部分研究目的在于研究假基因PDIA3P1影響肝細(xì)胞肝癌生物學(xué)功能的作用。方法:利用小干擾RNA(siRNA)敲低SMMC-7721及HepG2肝癌細(xì)胞中表達(dá),利用Transwell、EdU、cck8、流式細(xì)胞儀等實(shí)驗(yàn)方法檢驗(yàn)其細(xì)胞功能學(xué)的改變;同時(shí)利用發(fā)卡RNA(shRNA)建立低表達(dá)假基因PDIA3P1穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系:SMMC-7721和HepG2細(xì)胞,進(jìn)行克隆形成實(shí)驗(yàn),檢測(cè)肝癌細(xì)胞克隆集落形成能力,并建立裸鼠皮下成瘤及腫瘤轉(zhuǎn)移模型,檢測(cè)假基因PDIA3P1對(duì)肝癌細(xì)胞成瘤能力的影響。結(jié)果:敲低SMMC-7721及HepG2細(xì)胞中的假基因PDIA3P1后,細(xì)胞呈現(xiàn)增殖減慢、遷移能力、侵襲能力下降及凋亡增加的趨勢(shì);裸鼠皮下成瘤瘤體生長(zhǎng)減緩。結(jié)論:假基因PDIA3P1是潛在的促癌基因,有促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移侵襲,抑制凋亡的作用。第三部分假基因PDIA3P1影響肝癌細(xì)胞功能改變的機(jī)制目的:探究假基因調(diào)控肝癌細(xì)胞生物學(xué)功能改變的機(jī)制。方法:進(jìn)行細(xì)胞爬片熒光原位雜交(FISH),檢測(cè)假基因PDIA3P1在肝癌細(xì)胞中的定位;通過(guò)表達(dá)譜芯片探索PDIA3P1影響肝細(xì)胞肝癌功能學(xué)改變的機(jī)制。結(jié)果:細(xì)胞熒光原位雜交實(shí)驗(yàn)證實(shí)假基因PDIA3P1在細(xì)胞中大部分定位于細(xì)胞核中;表達(dá)譜芯片及Western Blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)敲低假基因PDIA3P1后,p53通路蛋白cyclin E1發(fā)生了明顯的降低,p53、p21、PERP、IGFBP3、發(fā)生了明顯的升高。結(jié)論:假基因PDIA3P1通過(guò)p53通路調(diào)控肝細(xì)胞肝癌生物學(xué)功能的改變。
【學(xué)位單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R735.7
【部分圖文】：

胞、ＳＫ－Ｈｅｐｌ細(xì)胞、ＨｅｐＧ２細(xì)胞、ＨＣＣＬＭ３細(xì)胞和ＳＭＭＣ－７７２１細(xì)胞）以及一種??正常肝細(xì)胞株（Ｌ０２）中的表達(dá)情況，我們發(fā)現(xiàn)五種肝癌細(xì)胞株相對(duì)于正常肝細(xì)胞??表達(dá)明顯升高（圖１－１）。??氏?１５０］??１Ｊ?議??Ｉ』國(guó)＿??１Ｊ，?Ｂ?ｆｉ?Ｂ?■?１??①?ｕ?ＩＩ?｜?－?ｉ?ＩＩ??？ｖｖｖｙ??圖１－１細(xì)胞株中ＲｅａｌＴｉｍｅ?ＰＣＲ檢測(cè)假基因ＰＤＩＡ３Ｐ１的相對(duì)表達(dá)量??（以ＧＡＰＤＨ為內(nèi)參）??３．２假基因ＰＤＩＡ３Ｐ１在肝細(xì)胞肝癌組織中高表達(dá)??為確定假基因ＰＤＩＡ３Ｐ１在姐織中的表達(dá)情況，我們通過(guò)ＲＴ－ＰＣＲ檢測(cè)了本院??９０例肝細(xì)胞肝癌患者的組織，每例組織都有與其配對(duì)的正常癌旁俎織。我們發(fā)現(xiàn)，??１４??

第一部分假基因ＰＤＩＡ３ＰＩ在肝細(xì)胞肝癌中的表達(dá)及其臨床意義??在９０例配對(duì)組織中有５６對(duì)組織中ＰＤＩＡ３Ｐ１的表達(dá)出現(xiàn)癌組織比癌旁組織表達(dá)量??升高的情況（圖１－２），癌組織中假基因ＰＤＩＡ３Ｐ１的表達(dá)與癌旁組織中ＰＤＩＡ３Ｐ１??的表達(dá)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，癌組織中ＰＤＩＡ３Ｐ１表達(dá)量明顯高于癌旁組織（圖１－３）。??ＰＤＩＡ３Ｐ１?ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｄ?ｉｎ?ｔｕｍｏｒ?（５６．７％）??ｃｏｍｐａｒｅ?ｔｏ?ｎｏｒｍａｌ?ｔｉｓｓｕｅ??〇?１－５－１??｜?１．０－?ｊ??－Ｑ?ｇＢｌｌｌｌＩｌ??￣?〇＿５＿??＾。＿。－畫(huà)圓圓ｉ腳丨舖＿酬麵誦ＩＩ畫(huà)圓畫(huà)畫(huà)??〇?－０．５－?ＩＰ??？?Ｉ＂??１－１．０」??圖１－２?９０例組織中有５６例組織假基因ＰＤ丨Ａ３Ｐ１呈高表達(dá)??１５??

第一部分假基因ＰＤＩＡ３ＰＩ在肝細(xì)胞肝癌中的表達(dá)及其臨床意義??在９０例配對(duì)組織中有５６對(duì)組織中ＰＤＩＡ３Ｐ１的表達(dá)出現(xiàn)癌組織比癌旁組織表達(dá)量??升高的情況（圖１－２），癌組織中假基因ＰＤＩＡ３Ｐ１的表達(dá)與癌旁組織中ＰＤＩＡ３Ｐ１??的表達(dá)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，癌組織中ＰＤＩＡ３Ｐ１表達(dá)量明顯高于癌旁組織（圖１－３）。??ＰＤＩＡ３Ｐ１?ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｄ?ｉｎ?ｔｕｍｏｒ?（５６．７％）??ｃｏｍｐａｒｅ?ｔｏ?ｎｏｒｍａｌ?ｔｉｓｓｕｅ??〇?１－５－１??｜?１．０－?ｊ??－Ｑ?ｇＢｌｌｌｌＩｌ??￣?〇＿５＿??＾。＿。－畫(huà)圓圓ｉ腳丨舖＿酬麵誦ＩＩ畫(huà)圓畫(huà)畫(huà)??〇?－０．５－?ＩＰ??？?Ｉ＂??１－１．０」??圖１－２?９０例組織中有５６例組織假基因ＰＤ丨Ａ３Ｐ１呈高表達(dá)??１５??
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