甜瓜(Cucumis melo L.)是全世界廣泛栽培的一種重要的經(jīng)濟(jì)類瓜果作物,貯藏性是甜瓜經(jīng)濟(jì)價(jià)值最重要的影響因素之一。乙烯在甜瓜果實(shí)成熟過程中發(fā)揮重要作用,而ERF又是乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中重要的轉(zhuǎn)錄因子,然而ERF在甜瓜果實(shí)發(fā)育過程中的功能仍然未知。本研究利用生物信息學(xué)方法分析了甜瓜ERF轉(zhuǎn)錄因子亞家族64個(gè)成員蛋白序列特性及其基因的啟動(dòng)子元件。以甜瓜品種河套蜜瓜為試材,使用實(shí)時(shí)定量PCR的方法構(gòu)建了該亞家族成員在不同組織和不同發(fā)育時(shí)期果實(shí)中的表達(dá)譜,獲得了 8個(gè)在果實(shí)發(fā)育中高表達(dá)的候選基因。利用瞬時(shí)表達(dá)的方法分析了候選基因的功能,進(jìn)一步用候選基因的過表達(dá)、RNAi和基因編輯載體進(jìn)行穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化甜瓜,分析其在果實(shí)發(fā)育過程中的功能。主要結(jié)果如下:1.生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)甜瓜64個(gè)ERF蛋白的分子量介于14.00 kDa~46.62 kDa;40個(gè)蛋白的理論等電點(diǎn)小于7;預(yù)測(cè)所有蛋白均為親水性蛋白;除CmERFIV-5,其他蛋白都是不穩(wěn)定蛋白;58個(gè)蛋白定位于細(xì)胞核內(nèi)、1個(gè)蛋白位于細(xì)胞質(zhì)、5個(gè)蛋白定位于葉綠體;28個(gè)蛋白含有信號(hào)肽;64個(gè)基因獲得83種啟動(dòng)子元件,其中包含赤霉素、茉莉酸、生長素、水楊酸、脫落酸和乙烯的不同應(yīng)答元件,還包括厭氧、低溫、熱、干旱、創(chuàng)傷和真菌脅迫的不同應(yīng)答元件;進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)ERF在不同物種間相對(duì)保守;64個(gè)基因在12條染色上呈不均勻分布。2.實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)64個(gè)CmERFs在根、莖、葉,9 d、18 d、27 d、36 d、呼吸躍變期和躍變后期果實(shí)中的表達(dá)量,發(fā)現(xiàn)8個(gè)基因在呼吸躍變期高表達(dá),且在躍變期和躍變后期的表達(dá)量存在顯著差異,其中(CmERFⅠ-15、CmERⅡ-9、CmERFⅣ-2、CmERFⅣ-3在呼吸躍變后期的表達(dá)量顯著高于根、莖、葉中的表達(dá)量。3.利用瞬時(shí)表達(dá)分析8個(gè)基因在果實(shí)發(fā)育中的功能,發(fā)現(xiàn)過表達(dá)CmERFⅠ-15、CmERFⅡ-9、CmERFⅢ-1、CmERFⅣ-2、CmERFⅣ-3、CmERFⅤ-4促進(jìn)成熟,RNAi抑制其表達(dá)則延遲成熟;過表達(dá)CmERFI-18和CmERFⅢ-13延遲成熟,RNAi抑制其表達(dá)則促進(jìn)成熟。4.選擇瞬時(shí)表達(dá)效果最明顯的五個(gè)基因:CmERFⅠ-CmERFⅡ-9、CmERFⅢ-1和CmERFⅣ-2CmERFⅣ-3構(gòu)建基因編輯載體。將8個(gè)基因的過表達(dá)、RNAi載體和5個(gè)基因的基因編輯載體分別穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化至甜瓜。分析T3轉(zhuǎn)化果實(shí)成熟期,發(fā)現(xiàn)Cm2ERFⅠ-15的三個(gè)過表達(dá)株系分別比野生型早熟7.58天、7.47天和6.98天,RNAi三個(gè)株系分別比野生型晚熟9.20天、10.60天和11.08天,基因編輯三個(gè)株系分別比野生型晚熟13.23天、14.63天和14.53天;(CmERFⅡ-9的三個(gè)過表達(dá)株系分別比野生型早熟6.05天、6.35天和5.05天,RNAi三個(gè)株系分別比野生型晚熟8.15天、8.30天和9.10天,基因編輯三個(gè)株系分別比野生型晚熟11.80天、12.40天和12.75天。5.分別采摘CmERFⅠ-15授粉后28天的過表達(dá)果實(shí)、授粉后45天的RNAi果實(shí)和授粉后50天的基因編輯果實(shí),采摘CmERFⅡ-9授粉后29天的過表達(dá)果、授粉后44天的RNAi果實(shí)和授粉后48天的基因編輯果實(shí),測(cè)定上述果實(shí)采后的呼吸速率,發(fā)現(xiàn)CmERFⅠ-15和CmERFⅡ-9過表達(dá)果實(shí)分別在采后18.24小時(shí)和20.74小時(shí)出現(xiàn)呼吸峰值,分別比野生型提早7.16小時(shí)和4.66小時(shí)出現(xiàn);兩個(gè)基因的RNAi果實(shí)分別在采后31.81小時(shí)和31.65小時(shí)出現(xiàn)呼吸峰值,分別比野生型延遲6.54小時(shí)和6.25小時(shí)出現(xiàn);兩個(gè)基因的基因編輯果實(shí)分別在采后33.44小時(shí)和32.24小時(shí)出現(xiàn)呼吸峰值,分別比野生型延遲8.04小時(shí)和6.84小時(shí)出現(xiàn)。CmERFI-15和CmERFII-9的過表達(dá)果實(shí)采后硬度下降速度較野生型快,而RNAi和基因編輯果實(shí)的硬度下降速度較野生型慢。6.檢測(cè)ACS和ACO在轉(zhuǎn)基因果實(shí)中的表達(dá)量,發(fā)現(xiàn)CmACOI在CmERFI-15轉(zhuǎn)基因果實(shí)呼吸躍變前期的表達(dá)量與野生型存在極顯著差異,表現(xiàn)為CmERFI-15與CwACO1的表達(dá)量呈正相關(guān);CmACO3在CmERFI-15和CmERFII-9轉(zhuǎn)基因果實(shí)呼吸躍變前期和躍變期的表達(dá)量與野生型存在極顯著差異,表現(xiàn)為CmERFI-15和CmERFII-9與CmACO3的表達(dá)量呈正相關(guān);CmACS5在CmERFII-9轉(zhuǎn)基因果實(shí)呼吸躍變期的表達(dá)量與野生型存在極顯著差異,表現(xiàn)為CmERFII-9與CmACS5的表達(dá)量呈正相關(guān)。綜上研究結(jié)果表明,甜瓜ERF轉(zhuǎn)錄因子基因CmERFI-15和CmERFII-9具有促進(jìn)果實(shí)成熟的功能。
【學(xué)位單位】：內(nèi)蒙古大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S652
【部分圖文】：

合成途徑被提出：Ｍｅｔ?經(jīng)?Ｙａｎｇ－ｃｙｃｌｅ?形成?ＳＡＭ，ＳＡＭ?在?ＡＣＣ?合成酶（ＡＣＣ?ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ，ＡＣＳ）??作用下產(chǎn)生ＡＣＣ和ＭＴＡ，ＡＣＣ在ＡＣＣ氧化酶（ＡＣＣ?ｏｘｉｄａｓｅ，ＡＣＯ）作用下生成乙烯［１５］??（圖１．１）。ＡＣＳ和ＡＣＯ是乙烯合成過程中的關(guān)鍵酶，甜瓜中已分離獲得６個(gè)Ｕ基因，包??括？和其中屬于誘導(dǎo)基因，在成熟的果實(shí)和種子中??檢測(cè)到該基因的表達(dá)量較高［１６］；?和則在甜瓜果實(shí)發(fā)生呼吸躍變前表達(dá)［１７，１８］；??而在甜瓜果實(shí)成熟期高表達(dá)，但是該基因不受乙烯調(diào)控［１９］；?的功能仍屬未??知；此外，還發(fā)現(xiàn)基因決定甜瓜花的性別分化本實(shí)驗(yàn)室利用花粉管通道法將反義??沿基因轉(zhuǎn)入河套蜜瓜并獲得耐貯藏甜瓜新品系［２１］。甜瓜中已克隆５個(gè)基因，其中??的表達(dá)受乙烯誘導(dǎo)，且隨著果實(shí)成熟表達(dá)量顯著增加，本實(shí)驗(yàn)室利用花粉管通道法??將反義〇以Ｃ０／基因轉(zhuǎn)入河套蜜瓜，獲得另一耐貯藏甜瓜新品系Ｐ２，２３Ｌ?和??在果實(shí)成熟過程中未檢測(cè)到表達(dá)量［２４］。和則在果實(shí)成熟過程中差異表達(dá)

烯受體的活性［４７］；?ＲＴＥ１通過與ＥＴＲ１直接相互作用負(fù)調(diào)控乙烯反應(yīng)［４８］；受乙烯調(diào)控的Ｆ－ｂｏｘ??蛋白ＥＴＰ１／ＥＴＰ２通過ＵＰＰ降解ＥＩＮ２［４９］；?ＥＩＮ３／ＥＩＬＳ還會(huì)受到ＪＡＺ等蛋白負(fù)調(diào)控［５°］。這些新??成員的發(fā)現(xiàn)，使得原本為線性模型的乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑呈現(xiàn)出更為復(fù)雜的輻射狀模型（圖１．２）。??甜瓜中已分離獲得乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的多個(gè)元件。甜瓜乙烯受體基因０／＾７７？／和??已被克隆，并發(fā)現(xiàn)伴隨果實(shí)的成熟，兩個(gè)基因的表達(dá)量呈上升趨勢(shì)［５１，５２］。姚遠(yuǎn)從甜??瓜中克隆得到基因，通過表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)，該基因隨著果實(shí)成熟表達(dá)量逐漸上升，??授粉后２０到３０天時(shí)表達(dá)量趨于穩(wěn)定，４０天時(shí)開始緩慢下降［５３］。高峰從甜瓜中克隆得到??Ｏｗ－Ｅ／Ｚ八Ｏｗ－￡／Ｌ２兩個(gè)基因，對(duì)其在果實(shí)發(fā)育過程中的表達(dá)量分析發(fā)現(xiàn)，兩個(gè)基因在果實(shí)??成熟過程中的表達(dá)量逐漸上升，在授粉后３５天時(shí)表達(dá)量達(dá)到峰值，ＣＷ－Ｅ７Ｚ２在授粉??后４０天時(shí)表達(dá)量達(dá)到峰值［５４］。??５??

晝夜：８Ａ６ｈ）的３５日齡無菌苗，分別采集根、莖、葉和子葉，速凍于液氮中，用??于基因的表達(dá)分析。采摘授粉啟９?ｄ、１８?ｄ、２７ｄ、３６ｄ的果實(shí)以及采后處于呼吸躍變期、躍變??后期的果實(shí)（見圖２．１），取中果皮組織速凍于液氮中，用于基因克隆和表達(dá)分析。??ｒ?：：：才??圖２．１不同發(fā)育時(shí)期的果實(shí)??Ａ：授粉后９?ｄ果實(shí)；Ｂ：授粉后１８?ｄ果實(shí)；Ｃ：授粉后２７?ｄ果實(shí)；Ｄ：授粉后３６?ｄ果實(shí)；Ｅ：呼吸躍期果??實(shí)；Ｆ：呼吸躍變后期果實(shí)??Ｆｉｇｕｒｅ２．１?Ｆｒｕｉｔｓ?ａｔ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ?ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ?ｓｔａｇｅｓ．??Ａ：?Ｆｒｕｉｔ?ａｔ?９?ＤＡＰ?（Ｄａｙ?ａｆｔｅｒ?ｐｏｌｌｉｎａｔｉｏｎ）；?Ｂ：?Ｆｒｕｉｔ?ａｔ?１８?ＤＡＰ；?Ｃ：?Ｆｒｕｉｔ?ａｔ?２７?ＤＡＰ；?Ｄ：?Ｆｒｕｉｔ?ａｔ?３６?ＤＡＰ；?Ｅ：?Ｆｒｕｉｔ?ａｔ??ｃｌｉｍａｃｔｅｒｉｃ；?Ｆ：?Ｒｒｕｉｔ?ａｔ?ｐｏｓｔ－ｃｌｉｍａｃｔｅｒｉｃ??１４??
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